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背景与目的:我国胃癌现状主要为早诊率低,大量III/IV期患者术后生存时间短。因此,针对我国胃癌现状,亟需推进胃癌早期诊断、治疗方案优化及精准化治疗的相关研究。人类基因组中存在大量功能未知的非编码RNA,探究非编码RNA在肿瘤中的作用,有助于明确肿瘤形成的具体分子机制。非编码RNA的众多功能中,竞争内源性RNA(ceRNA)作用方式被研究人员深入探讨,并且鉴于其网络调节模式,探究核心作用分子有助于筛选肿瘤靶向治疗的靶标进而改善肿瘤治疗效益。纤维粘连蛋白(FN)是一种存在于细胞外基质(ECM)的多功能蛋白,FN1作为该家族中的一种大分子糖蛋白,其在肿瘤微环境中发挥着诸多作用。但在肿瘤细胞内部,尤其是胃癌细胞内,FN1在RNA层面发挥的功能及在RNA和蛋白层面是否存在功能差异仍待进一步挖掘。因此,本研究旨在明确胃癌中FN1在RNA及蛋白层面的临床意义,通过体内外实验探究FN1 3’UTR对胃癌细胞的影响,并对比FN1在RNA及蛋白层面是否存在功能差异;通过二代测序技术构建FN1 3’UTR为核心的ceRNA调控网络并验证,筛选发挥核心作用的基因,深究FN1 3’UTR影响胃癌细胞的具体分子机制以及RNA及蛋白层面功能差异的分子基础。研究方法:本研究借助TCGA-STAD队列数据分析FN1 mRNA在胃癌及癌旁组织中的表达水平。利用原位杂交实验获得的222例来自中国医科大学附属第一医院的胃癌患者癌组织FN1 3’UTR表达水平及前期研究中获得的102例来自中国医科大学附属第一医院的胃癌患者癌组织FN1蛋白表达水平数据,分析FN1 3’UTR及FN1蛋白与临床资料之间的相关性。生存分析探究多个队列中FN1在RNA及蛋白层面表达水平与预后的关系。通过Western Blot及qRT-PCR实验检测胃癌细胞系中FN1在RNA及蛋白层面的表达水平并挑选合适细胞系进行后续实验。通过质粒转染构建FN1 3’UTR过表达细胞及FN1蛋白过表达细胞,利用迁移侵袭实验、划痕实验及粘附实验体外评估细胞侵袭转移功能;利用慢病毒构建稳定过表达FN1 3’UTR细胞系,裸鼠尾静脉注射及腹腔注射肿瘤细胞进行体内评估细胞侵袭转移能力。通过转录组测序及RNA pull-down后的miRNA测序获得FN1 3’UTR过表达后上调的差异表达基因(DEGs)及高度富集的miRNA,分析FN1 3’UTR过表达后细胞发生的功能及信号通路改变,并构建FN1 3’UTR为核心的ceRNA调控网络,借助公开数据库数据筛选促癌靶基因并构建促癌子网络及核心子网络。利用qRT-PCR、功能实验及双荧光素酶报告基因实验对FN1 3’UTR—miRNA的调控关系进行验证。通过Western Blot及qRT-PCR实验验证核心子网络中miRNA—靶基因的调控关系。利用RIP实验验证FN1 3’UTR调控靶基因的ceRNA作用机制。利用Western Blot对测序数据分析中FN1 3’UTR过表达后产生的信号通路改变进行验证。通过生物信息学分析对靶基因进行筛选,以作为后续挖掘深入作用机制的关键靶基因。进一步干预关键靶基因,探究靶基因与FN1 3’UTR引起的表型改变的关系。结果:分析TCGA-STAD胃癌患者队列的转录组表达谱及临床病理资料数据发现,FN1 mRNA在375例患者癌组织中的表达水平显著高于32例患者癌旁组织,且表达水平与T分期及肿瘤分化程度显著相关。通过原位杂交实验分析222例临床患者癌组织样本FN1 3’UTR的表达水平发现,FN1 3’UTR在65.8%的患者中呈高表达,且表达水平与患者T分期(P=0.025)及N分期(P=0.031)显著相关,高表达患者提示不良表型;分析课题组在前期研究中获取的102例临床患者癌组织FN1蛋白表达数据发现,FN1蛋白表达水平仅与患者T分期(P=0.028)有关。预后分析中,TCGA-STAD队列、ACRG队列(GSE62254数据集)及222例临床患者队列中均发现FN1 mRNA或3’UTR高表达患者的术后生存显著劣于低表达患者(P均小于0.05),且FN1 3’UTR表达水平在222例患者队列的单多因素分析中提示可作为预后判断的独立风险因素;而102例临床患者队列中并未发现FN1蛋白表达水平与预后的相关性(P=0.807)。通过Western blot及qRT-PCR实验检测SGC7901、MGC803、HGC27、AGS及MKN45胃癌细胞系中FN1 3’UTR、FN1 mRNA及FN1蛋白的表达水平,发现它们在HGC27及AGS中的表达水平最低。功能实验发现,FN1 3’UTR过表达后可显著提高胃癌细胞的迁移侵袭能力、划痕愈合速度及粘附能力,转染相同质粒量的情况下FN1蛋白过表达后对上述能力的促进程度低于FN1 3’UTR过表达。构建稳定过表达FN1 3’UTR的细胞系,对稳定过表达FN1 3’UTR的HGC27细胞及阴性对照细胞系进行转录组测序,分析获得323个DEGs(241个上调DEGs及82个下调DEGs);转录组测序数据GSEA分析发现,FN1 3’UTR还影响细胞上皮-间充质转化(EMT)相关信号通路、TGFβ信号通路及ECM中受体结合作用。基于测序数据分析结果,进一步探究胃癌细胞与间皮细胞之间的作用,发现HMr SV5间皮细胞在分别与FN1 3’UTR过表达、FN1蛋白过表达及阴性对照细胞共培养后,对胃癌细胞的粘附及侵袭抵抗的能力存在差异:与FN1 3’UTR过表达或FN1蛋白过表达的细胞共培养后,相比于对照组,HMr SV5对胃癌细胞的屏障能力减弱,其中FN1 3’UTR过表达细胞共培养后的HMr SV5最弱;粘附实验提示,HMr SV5与FN1 3’UTR过表达细胞共培养后对胃癌细胞的粘附能力显著增强,且强于与FN1蛋白过表达细胞共培养后的HMr SV5。体内实验中,裸鼠尾静脉注射实验中发现FN1 3’UTR过表达后可促进胃癌细胞在肺组织或周身形成转移灶,腹腔注射后同样发现FN1 3’UTR过表达细胞更易在腹腔内种植。为进一步构建ceRNA调控网络,对稳定过表达FN13’UTR的HGC27及AGS细胞进行RNA pull-down实验,并通过miRNA测序获得FN1 3’UTR高度富集的59个miRNA,进一步筛选获得16个miRNA并利用Target Scan 7.2和DIANA Micro T-CDS数据库预测靶基因,与241上调DEGs联合分析后构建出FN1 3’UTR为核心,通过高度富集16个miRNA进而调节66个靶基因表达的ceRNA调控网络;利用ACRG队列的表达谱及预后数据,获得靶基因中发挥促癌作用的14个基因并构建促癌子网络及核心子网络。为了初步验证核心子网络中FN1 3’UTR与hsa-let-7i-5p、hsa-mi R-629-5p、hsa-mi R-423-5p、hsa-mi R-296-3p的关系,分别转染上述4个miRNA-mimics后发现均可下调细胞中FN1 3’UTR表达水平,可恢复FN1 3’UTR高表达后的促癌作用,且双荧光素酶报告基因实验提示4个miRNA与FN1 3’UTR存在结合调控关系。通过Western blot、qRT-PCR实验及数据库预测的方式明确了核心子网络中let-7i-5p可下调THBS1、CPED1的表达及mi R-629-5p可下调AMOTL2的表达。通过生物信息学分析发现,THBS1、CPED1及AMOTL2与FN1 mRNA表达水平呈正相关,其中THBS1的相关度最高,且THBS1高表达在ACRG队列及TCGA-STAD队列中均提示不良预后。通过Anti-Ago2的RIP实验证实了FN1 3’UTR通过竞争性富集miRNA及RNA诱导沉默复合体进而调控THBS1、CPED1及AMOTL2表达水平的ceRNA调控机制。基于GSEA富集分析结果,通过免疫荧光染色实验、Western Blot及Elisa实验发现FN1 3’UTR过表达后可明显促进EMT的转变(上调N-cadherin、Slug及Snail,下调E-cadherin、ZO1、β-catenin及CLDN1),上调MMP2/9及TGFβ1/2的表达及外分泌作用。筛选THBS1作为ceRNA网络中的关键靶基因,利用siTHBS1下调FN1 3’UTR过表达细胞中THBS1的表达水平,功能实验评估发现下调THBS1表达水平可逆转FN1 3’UTR高表达后驱动的促癌作用,且可影响FN1 3’UTR过表达后驱动的EMT表型改变及MMP2/9表达水平。免疫荧光染色实验发现FN1蛋白过表达组细胞EMT程度低于FN1 3’UTR过表达组,且FN1 3’UTR过表达细胞中THBS1的表达水平及THBS1正向调控的TGFβ1/2外分泌水平均高于FN1蛋白过表达组。结论:1.胃癌中,FN1 3’UTR高表达患者术后生存时间显著短于低表达患者,可作为胃癌患者预后判断的独立风险因素,且其表达水平与侵袭表型相关病理资料有关;2.体内外实验中,FN1 3’UTR过表达后可显著提高胃癌细胞的侵袭转移能力,且在体外实验中证实FN1 3’UTR促进细胞恶性表型的能力可能高于FN1蛋白;3.基于测序数据分析结果提示,在胃癌细胞中FN1 3’UTR作为核心调控着庞大的ceRNA作用网络,其中已证实FN1 3’UTR可通过富集hsa-let-7i-5p、hsa-mi R-629-5p、hsa-mi R-423-5p、hsa-mi R-296-3p导致THBS1、CPED1及AMOTL2的表达上调,进而发挥促癌作用;4.FN1 3’UTR可能通过促进EMT、上调TGFβ1/2及MMP2/9的表达及外分泌的方式促进胃癌细胞侵袭转移;5.FN1 3’UTR—let-7i-5p—THBS1轴为FN1 3’UTR通过ceRNA调控网络发挥促癌作用的核心机制之一,同时该轴可能是FN1 3’UTR发挥异于FN1蛋白促癌作用的主要因素之一。