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1目的以传统中医药理论和中药药效组分理论为指导,研究经方栀子柏皮汤清热利湿的药效组分,探讨配伍、剂量、剂型对药效组分的影响,为建立栀子柏皮汤与临床疗效对应的药效组分质量评价体系提供科学依据,为药效组分标准物质的制备和中药药效组分新药的研制提供关键技术和方法。2方法本文以经方栀子柏皮汤(《伤寒论》)为研究载体,通过文献溯源法考证“栀子柏皮汤”的临床基原,依据经方原则、剂型原则、溶解性原则和临床疗效原则选定目前研究较成熟、药理作用明确且与复方功能主治相关的10种成分:栀子苷、京尼平龙胆双糖苷、西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ、木兰花碱、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、甘草酸、甘草苷、异甘草苷作为药效组分解析的目标成分,通过HPLC-DAD多波长切换法测定药效组分含量,通过数据分析法解析药效组分与配伍、剂量、剂型因素的内在联系。色谱条件:Syncronis C18 色谱柱(250mm×4.6mm,5μm);流动相:乙腈(A)—0.2%磷酸(B);梯度洗脱:0～20min,12%～20%A;20～40min,20%～23%A;40～70min,23%25%A;70～100min,25%～55%A;100～105min,55%～12%A;沆 0.8mL/min;柱温30℃;进样量5μL;检测波长238nm(栀子苷、京尼平龙胆双糖苷、木兰花碱、甘草苷);265nm(盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、甘草酸);360nm(异甘草苷);440nm(西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ)。3结果(1)栀子柏皮汤清热利湿的药效组分解析①药效组分选定:根据栀子柏皮汤的配方、剂型和功效,选择了与其清热利湿功效相对应的药效组分:栀子苷-京尼平龙胆双糖苷-西红花苷Ⅰ-西红花苷Ⅱ-盐酸小檗碱-盐酸巴马汀-木兰花碱-甘草酸-甘草苷-异甘草苷。②方法学考察:10种药效组分专属性强、无杂质干扰;在相应的线性范围内均呈现良好的线性关系(r2≥0.9992);平均回收率在96.53～100.25%范围内,RSD小于3%;精密度、重复性以及稳定性试验中的RSD均小于 1.5%。(2)栀子柏皮汤药效组分的影响因素研究①剂型因素:剂型对栀子柏皮汤药效组分有显著性的影响(P<0.05)。随着煎煮时间的延长,栀子、黄柏、炙甘草药效组分均在10~20min有大幅度上升,20min后出现不同程度的减少后含量增加,最终含量与20min时大致相近。栀子柏皮汤药效组分总量同栀子药效组分总量变化一致,其含量由高到低为(mg/g):60min(39.526±0.821)>20 min(38.728士0.263)>30 min(38.192±0.307)>50 min(37.560±0.731)＞ 10 min(34.715±0.322)>40min(33.494±0.525)。采用不同的提取方法,回流法提取时药效组分总量大于超声法;采用不同的提取溶剂,回流法提取时药效组分总量大小顺序为:30%乙醇(287.265±0.945)>60%乙醇(242.904±0.647)＞90%乙醇(241.764±0.856)>水(100.364±0.746),超生法提取时药效组分总量大小顺序为:30%乙醇(169.897±0.653)>90%乙醇(144.123±0.787)>60%乙醇(122.717±0.836)＞水(25.180±0.367),栃子柏皮汤药效组分在30%乙醇中的溶出量最大。②配伍因素:栀子、黄柏、炙甘草三者配伍后,与单味药相比药效组分含量发生明显变化(P<0.05)。栀子单味药药效组分的含量(mg/g):栀子苷(51.551±0.784)-京尼平龙胆双糖苷(11.444±0.232)-西红花苷Ⅰ(5.999±0.291)-西红花苷Ⅱ(0.597±0.053),配伍后药效组分总量下降了 12.5%;黄柏单味药药效组分的含量(mg/g):木兰花碱(5.390±0.359)-盐酸小檗碱(5.147±0.545)-盐酸巴马汀(1.873±0.057),配伍后药效组分总量下降了 9.21%;炙甘草单味药药效组分的含量(mg/g):甘草苷(8.621±0.251)-异甘草苷(0.702±0.094)-甘草酸(14.612±0.847),配伍后药效组分总量上升了 8.17%,栀子柏皮汤清热利湿的药效组分含量为:栀子苷(44.998±0.625)-京尼平龙胆双糖苷(9.707±0.245)-西红花苷Ⅰ(5.599±0.352)-西红花苷Ⅱ(0.586±0.012)-木兰花碱(4.567±0.324)-盐酸小檗碱(3.294±0.211)-盐酸巴马汀(1.406±0.196)-甘草苷(8.265±0.614)-异甘草苷(0.833±0.055)-甘草酸(16.883±0.602)。改变配伍组分时,栀子柏皮汤中栀子药效组分总量、黄柏药效组分总量、炙甘草药效组分总量均下降(P<0.05),栀子柏皮汤药效组分总量变化规律为:生栀子-生黄柏-炙甘草(43.651±0.625)＞炒栀子-生黄柏-炙甘草(39.993±0.547)>生栀子-盐黄柏-炙甘草(38.603±0.258)＞生栀子-酒黄柏-炙甘草(38.442±0.335)>生桅子-生黄柏-生甘草(37.713±0.681)>焦栀子-生黄柏-炙甘草(13.961±0.414)。③剂量因素:a.单因素栀子配伍剂量变化,配伍饮片栀子、黄柏、炙甘草及栀子柏皮汤药效组分总量均发生明显改变(P<0.05)。黄柏、炙甘草剂量不变,栀子配伍剂量分别为1g,3g,6g,10g,12g,15g,18g时,栀子和炙甘草的药效组分总量呈上升趋势;黄柏药效组分总量呈先升高后降低的趋势;栀子柏皮汤药效组分总量逐渐上升,依次为 14.023±0.812,23.162±0.536,31.632±0.385,39.535±0.625,42.837士0.724.,47.392±0.048,52.826±0.326,黄柏、炙甘草与栀子的药效组分总量比例的变化范围是1:3.6:10~1:1.8:7。b.单因素黄柏配伍剂量变化,配伍饮片栀子、黄柏、炙甘草及栀子柏皮汤药效组分总量均发生明显改变(P＜0.05)。栀子、炙甘草剂量固定不变,黄柏配伍剂量由1g变化到15g时,炙甘草药效组分总量下降;黄柏药效组分总量上升;栀子药效组分总量先升后降;栀子柏皮汤药效组分呈先升高后下降的趋势,在经方剂量6g处有最大值,黄柏、炙甘草与栀子的药效组分总量比例的变化范围是:1:2.7:6~1:1.6:4.3。当黄柏剂量为 1、3、6g 时,栀子柏皮汤药效组分总量偏高:38.024±0.749,41.155±0.385,41.257±0.564;黄柏剂量为 9、12、15g 时,药效组分总量偏低:34.475±0.460,28.43±0.843,25.234±0.590。c.单因素炙甘草配伍剂量变化,配伍饮片栀子、黄柏、炙甘草及栀子柏皮汤药效组分总量均发生显著变化(P＜0.05)。栀子、黄柏配伍剂量不变,炙甘草配伍剂量分别为1g,3g,6g,9g,12g,15g时,栀子、黄柏药效组分总量随炙甘草剂量的升高而降低;炙甘草药效组分总量逐渐上升;栀子柏皮汤药效组分总量呈现下降趋势,依次为50.479±0.326,46.901±0.585,41.431±0.650,37.76±0.865,34.54±0.840,32.29±0.492。黄柏、炙甘草与栀子的药效组分总量比例的变化范围是1:0.9:5.3~1:2:7。4结论(1)栀子柏皮汤清热利湿药效组分解析初步确定了与栀子柏皮汤清热利湿功效相关的10种药效组分:栀子苷-京尼平龙胆双糖苷-西红花苷Ⅰ-西红花苷Ⅱ-木兰花碱-盐酸小檗碱-盐酸巴马汀-甘草苷-异甘草苷-甘草酸,建立了栀子柏皮汤10种药效组分的HPLC-DAD多波长同时测定法,该操作方法具备较好的专属性、精密度和重现性,适用于栀子柏皮汤及其单味药的质量控制。(2)栀子柏皮汤药效组分的影响因素研究①剂型因素:a.汤剂的煎煮时间影响药效组分的含量,栀子柏皮汤中多数组分随煎煮时间的延长而增加;部分组分达到一定含量后趋于平稳;少数组分达到一定量后继续加热含量降低,因此一个时间点不能保证所有药效组分的最大溶出率或不受破坏。煎煮时间为20min时药效组分总量接近60min时的最大值,与传统煎煮时间的要求相符。b.改变提取方法和溶剂,药效组分亦发生改变。回流法提取时栀子柏皮汤各药效组分的溶出大于超声法,说明药效组分的溶出率受温度影响较大;各药效组分在一定浓度乙醇中的溶解度大于水中的溶解度,30%乙醇有利于栀子和黄柏药效组分的溶出,60%乙醇有利于炙甘草药效组分的溶出。因此,剂型的制备方法更改将导致有效物质发生改变,从而影响临床疗效。②配伍因素:a.栀子、黄柏、炙甘草与其他药味配伍前后药效组分含量均有显著性差异,说明复方中单味药的药效组分与配伍有关,栀子柏皮汤清热利湿药效组分是通过配伍实现的,去除方中任意一味药,都会对栀子柏皮汤的药效组分产生影响。b.改变配伍饮片,复方药效组分的含量发生变化,说明同一药材的不同炮制品代表不同的中药,具有不同的临床疗效,其根源在于药效组分的不同,应加以区分。当配伍组成为生栀子-生黄柏-炙甘草时,栀子柏皮汤10种药效组分的总量最大,验证了经方配伍组成的合理性。③剂量因素:改变栀子柏皮汤中单味药的剂量,栀子柏皮汤的药效组分与经方相比具有显著性差异。说明剂量影响配伍组分之间的相互作用程度,从而影响药效组分的含量和比例。不同含量和比例的药效组分代表不同的中药,临床疗效也不一样,因此临床用药时不能随意加减处方,应根据患者的病情合理调控处方用量。综上所述,中药质量控制指标的选取不应以个别几种成分或某一类成分为指标,应以体现中药整体性的药效组分作为考察指标;中药的配伍、剂量、剂型改变时,药效组分含量和比例随之发生变化,因此中药制备过程中应严格按照规范的工艺流程操作,临床用药时不可随意更改经方的配伍饮片和剂量。由于传统经方经过几千年的临床验证,其安全有效性不可替代,改变经方原有的配伍、剂量、剂型意味着中药的临床疗效发生了变化,不仅达不到理想的治疗效果,还会造成资源的浪费。