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背景与目的:目前,化疗是中晚期肝癌（Hepatocellularcarcinoma,HCC）临床主要的治疗措施,但化疗药物由于下列原因导致毒性大、疗效不佳:（1）弱或者无靶向性;（2）迅速建立的多药耐药性（MDR）。另外,HCC的发生发展涉及了众多基因的突变,有许多基因特别是癌相关基因参与癌发生（Oncogenesis）或者癌发展的作用、机理还不清楚。本实验室在前期筛选HCC靶向多肽（HCSP4,12aa）时,发现并预测到酪蛋白激酶2（casein kinase 2,CK2）可能是HCSP4的靶分子。所以,本研究从CK2研究入手,目的是证明:（1）CK2的表达是否与HCC的发展有关?（2）CK2是不是HCSP4的靶分子?其在HCC靶向治疗中的意义如何?CK2是一种蛋白激酶,分布广泛,可以磷酸化多种底物,它对基因表达、DNA损伤修复、蛋白质合成与降解、细胞分化、细胞周期控制、细胞增殖、凋亡等过程有重要的调控作用。CK2可以通过调节癌细胞的能量代谢来影响癌细胞的生长,可以改变相关凋亡因子的磷酸化水平,来改变癌细胞对凋亡的敏感度,是一种很有潜力的药物靶点,可能具有癌症治疗靶点的潜力。阿霉素（Doxorubicin,DOX）是一种抗癌药,它插入到DNA双螺旋中阻抑和干扰基因组转录而达到细胞毒作用,而CK2的催化亚基CK2α可转移到癌细胞的细胞核中发挥作用。CK2有可能通过磷酸化或去磷酸化抗凋亡蛋白的活性来参与癌细胞的化疗耐药。基于上述考虑,本研究应用CRISPR/Cas9技术对HCC细胞系HepG2进行了CK2基因敲除,首先揭示CK2在HCC发展中扮演的作用,再研究它作为化疗药物递送的靶点对于HCC细胞的体外效应。方法:1.Western blot 检测 HepG2 细胞、HEK293 细胞和 SGC-7901 细胞 CK2 表达。2.CK2α基因信息分析（NCBI数据库）,通过在线工具设计CK2α的sgRNA。3.合成sgRNAs,构建靶向CK2α基因Cas9载体。4.转染HepG2细胞,进行Cas9的靶向活性鉴定（T7E1法）。5.Cas9高活性转染细胞的抗性筛选（嘌呤霉素）。6.抗性筛选后细胞的单克隆化（有限稀释法）。7.阳性细胞克隆的筛选:（1）细胞克隆的CK2α的CRISPR靶点区域基因组序列测序;（2）根据测序分析结果,Western blot进一步确定疑似CK2α+/-HepG2、CK2α-/-HepG2的细胞克隆;（3）CK2α+/-HepG2、CK2α-/-HepG2 细胞克隆储存备用。8.CK2α的表达对HCC细胞恶性表型的影响:（1）以损伤修复法、Transwell、MTT、平板克隆形成等方法检测CK2α表达对HCC细胞增殖、运动力的影响;（2）通过考马斯亮蓝染色、扫描电镜等方法观察敲除CK2α后HepG2细胞运动相关微结构的变化;（3）利用流式细胞仪、DAPI染色法、Mitoview633法观察敲除CK2α后HepG2细胞的凋亡趋势变化。9.CK2α与HCSP4靶向的关系的研究:（1）分别以 HCSP4 噬菌体克隆与野生 HepG2、CK2α+/-HepG2、CK2α-/-HepG2细胞共孵育;（2）以抗M13抗体做ELISA和细胞免疫荧光检测。10.HCSP4-Lipo-DOX-miRNA101 的杀伤实验（1）脂质体（liposome,Lipo）载药体系构建及即靶向性确认。（2）转染后细胞存活率（MTT法）检测。11.利用数据库对CK2α生物信息学进行分析。结果:1.Western blot结果显示肝癌细胞中CK2高表达。2.成功获得了 CK2α+/-HepG2 以及 CK2α-/-HepG2 细胞系。3.MTT、平板克隆形成实验测定结果显示敲除CK2α表达后HepG2细胞的增殖受到明显抑制;4.损伤修复法、Transwell检测结果显示敲除CK2α表达后HepG2细胞的运动性明显受到抑制;5.考马斯亮蓝染色、电镜观察和四十倍白光照片结果显示敲除CK2α后HepG2细胞的运动相关微结构（伪足、丝状伪足）的发育具有显著抑制作用,细胞接触抑制性（Contact inhibition）明显得以恢复;6.流式细胞仪、DAPI和Mitoview633法结果显示敲除CK2α后HepG2细胞呈现一定的凋亡趋势;7.HCSP4噬菌体克隆与细胞的靶向亲和力实验（ELISA和细胞免疫荧光）结果显示敲除CK2α后HCSP4噬菌体对HepG2细胞的亲和力（Affinity）大大减弱;8.HCSP4-Lipo-DOX-miRNA101载药体系对HepG2细胞具有特异性,对敲除CK2α后HepG2细胞的杀伤力大大减弱。9.生物信息学分析结果提示:（1）CK2α基因在多种肿瘤中表达水平都发生了变异,在肝癌mRNA、蛋白水平都发生了变化;（2）这种变化使肝癌患者的存活率（预后）明显下降;（3）获得了 CK2α与其相关基因互作调控的网络图,为CK2α的进一步研究奠定了理论基础;结论:利用CRISPR/Cas9技术敲除CK2α基因后,获得了 CK2α-/-HepG2细胞系。以CK2α-/-HepG2细胞系为平台,所获得的一系列实验结果可以归纳出以下研究结论:1.CK2α在HCC的高表达对细胞的恶性程度有明显加强作用,实验结果支持CK2α在HCC至少是促癌基因;2.CK2α的高表达可使HCC细胞周期G1期加快,但是它的敲除没有明显增加HCC细胞的凋亡趋势;3.HCC细胞高表达的CK2是HCC靶向多肽HCSP4的结合位点;这一特异性结合对HCC靶向多肽导向的高效、低毒化疗药物靶向递送体系的研发具有重要意义;4.CK2α在HCC表达的mRNA和蛋白水平都较高,明显降低了肝癌患者的生存率。