论文部分内容阅读
目的:白血病细胞的多药耐药(multidrug resistance, MDR)几乎均存在凋亡抑制(apoptosis resistance)现象,白血病干细胞(leukemia stem cells, LSC)的存在是细胞产生耐药性以及白血病复发的主要因素。本研究比较观察纳米雄黄对白血病药物敏感的K562细胞和药物耐受的K562/ADM细胞及其白血病干细胞的凋亡诱导作用,并探讨纳米雄黄抗耐药性白血病细胞及其白血病干细胞的作用与机制。方法:采用机械研磨法制备纳米雄黄。以白血病药物敏感细胞K562细胞及其白血病耐药细胞K562/ADM细胞为靶细胞,采用四氮唑蓝比色法(MTT法)检测细胞的增殖活性,AnnexinV/PI双染色法检测细胞凋亡,流式细胞术检测Bax、Bcl-2、P53蛋白的表达水平和Caspase-3活性。采用流式细胞术检测干细胞免疫标志,以及耐药蛋白P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)和乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein, BCRP)的表达。结果:雄黄经球磨机球磨为超细微粉体,电镜测量纳米雄黄的平均粒径为(72.72+22.18)nm。纳米雄黄显著地抑制K562细胞和K562/ADM细胞的增殖。纳米雄黄作用24h、48h和72h,K562细胞的IC50值分别为43.48μg/ml、20.52μg/ml、16.07μg/ml; K562/ADM细胞的IC50值分别为56.53μg/ml、35.19μg/ml和24.75μg/ml。20μg/ml和50μg/ml纳米雄黄作用48h后,Annexin V/PI染色显示凋亡细胞明显增高:K562细胞凋亡率分别为10.52%和73.25%;K562/ADM细胞的凋亡率分别为13.35%和72.7%。雄黄原药呈时间浓度依赖性地抑制K562细胞和K562/ADM细胞的增殖并诱导其凋亡,但其作用均低于纳米雄黄。雄黄原药作用24h、48h和72h,K562细胞的IC50值分别为36.51μg/ml、33.26gg/ml、29.59gg/ml;K562/ADM细胞的ICso值分别为54.17μg/ml、21.76μg/ml和40.78μg/ml。20μg/ml和50μg/ml雄黄原药作用48h后,K562细胞凋亡率分别为9.12%和14.275%;K562/ADM细胞的凋亡率分别为3.82%和20.04%。20μg/ml和50μg/ml纳米雄黄处理K562细胞和K562/ADM细胞24h和48h,K562与K562/ADM细胞的P53、Bax、Bcl-2蛋白表达水平呈时间浓度依赖性增高,Bax/Bcl-2比值也随之升高。20μg/ml、50μg/ml纳米雄黄处理K562细胞与K562/ADM细胞12h和24h后,K562细胞Caspase-3蛋白活性显著增强。20μg/ml和50μg/ml的纳米雄黄处理K562细胞和K562/ADM细胞24h,靶细胞中LSC(CD34+CD38-CD123+)含量升高,尤以高浓度时明显;K562细胞中LSC凋亡细胞(Annexin V+)由对照的(1.21±0.76)%增高到(18.90±1.20)%与(54.80±3.20)%,K562/ADM细胞中LSC的凋亡率由对照的(3.68±0.85)%增高到(31.35±3.75)%与(49.50±8.90)%。20μg/ml和50μg/ml纳米雄黄处理K562细胞24h和48h后,细胞的BCRP、P-gp蛋白表达以及两者共表达增高,尤以高浓度时明显,50μg/ml处理后BCRP、P-gp蛋白表达以及两者共表达分别为(50.23±1.16)%、(81.85±0.35)%、(57.95±5.45)%和(59.11±1.84)%、(43.75±2.45)%和(55.35±1.55)%。20μg/ml和50μg/ml纳米雄黄作用24h和48h,K562/ADM细胞P-gp蛋白表达变化不明显,但BCRP蛋白以及BCRP、P-gp共表达呈上升趋势,50μg/ml处理24h和48hBCRP蛋白以及BCRP、P-gp共表达率依次为(44.45±2.30)%和(81.65±8.01)%、(44.05±2.25)%和(81.40±8.20)%。结论:纳米雄黄可显著抑制药物敏感的白血病K562细胞及其多药耐药株K562/ADM细胞的增殖活性,并通过Caspase依赖的线粒体途径诱导K562和K562/ADM群体细胞及其白血病干细胞凋亡;纳米雄黄对K562细胞和K562/ADM细胞的凋亡诱导效应均高于雄黄原药;耐药性白血病K562/ADM细胞及其白血病干细胞对纳米雄黄的敏感性与其药物敏感的亲本K562细胞相当。