研究背景：　　随着高血压、心脏瓣膜病、冠心病等心脏病的发病率逐年增高，压力超负荷和心肌梗死所致心力衰竭的发生率增高。心力衰竭在老年人群中预后差，其发病后5年内存活率与恶性肿瘤相仿。心室重构是心衰的基本病理机制，其主要特征包括病理性心肌肥大，心肌细胞凋亡，心脏成纤维细胞增殖与心肌间质纤维化。心肌细胞肥大是心室重构的起点，由此可导致心肌收缩力下降和心力衰竭。因此，探索以心肌肥厚为靶点的保护性因素，预防心力衰竭的发生，降低其死亡率有非常重要的意义。　　细胞内Ca2+浓度（[Ca2+]i）持续增加是诱导心肌肥大的重要机制，钙离子浓度的增加能加速心脏收缩功能障碍从而加快心衰的进程。有学者发现，钙离子通道抑制剂Bay k8644能够引起的[Ca2+]i升高，从而使肥大基因标记物[β肌球蛋白重链（β-myosin heavy chain,β-MHC）、心房尿钠因子（atrial natriuretic factor,ANF）、脑钠肽（brain natriuretic peptide,BNP）]的表达增加。钠钾ATP酶（Na+/ K+ - ATPase，NKA）是一个具有异二聚体结构的高度保守的膜蛋白，其由催化亚基α（在心脏中有α1和α2亚型）和调节亚基β（在心脏中仅有β1亚型）组成，早在1991年初，有学者已经发现，降低血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）的NKA活性可引起细胞内Na+的积累并最终导致[Ca2+]i的增加，该研究对糖尿病引起的高血压和动脉粥样硬化的发展起着重要的作用。NKA也是心肌细胞 Na+外排的主要通道，此外，最近的一项研究表明，NKAα2的过表达相比 NKAα1 亚型更能导致心肌细胞中 Na+的有效外排，进而通过钠钙交换（Na+/Ca2+-exchange，NCX）作用调节Ca2+外排。强心苷广泛用于治疗心力衰竭，其作用机制是抑制 NKA 的活性并且促进其反向模式 NCX 作用（三个 Na+外流，一个 Ca2+内流），从而阻断 Ca2+外流和增强心肌收缩力。动物实验证实，NKA 的过度活化可有效减轻主动脉弓缩窄性反应（transverse aortic constriction,TAC）诱导的心力衰竭。　　Klotho蛋白是一种新发现的具有抗衰老作用的蛋白，klotho基因突变的小鼠具有许多与衰老相关的表型，如寿命缩短，皮肤萎缩、肺水肿、骨质疏松症、不孕不育症、高磷血症和血管钙化。Klothol蛋白分为膜结合型和分泌型，膜结合型Klotho蛋白的胞外全长区可水解并分泌入血液，尿液和脑脊液，转换为分泌型 Klotho 蛋白，Klotho 蛋白可以保护血管内皮细胞免受氧化应激并抑制其凋亡。实验证实Klotho蛋白可以直接结合到血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）和瞬时受体电位Ca2+通道1（TRPC-1）的细胞膜并促进他们的胞吞作用，然而，在koltho基因敲除的小鼠中，由于klotho基因的缺乏使VEGFR / TRPC-1的内吞作用减弱，从而使细胞膜上的TRPC-1表达增加并最终导致[Ca2+]i增加。低浓度的钙使细胞膜上的NKA含量增加了12%，高浓度的钙反而使细胞膜上的NKA含量降低了8%。然而，在Klotho基因敲除的小鼠中，钙离子的浓度改变对NKA在脉络膜中的的活性表达并没有任何影响，这提示我们Klotho是募集NKA至细胞膜的一个必要因素。　　最近的一项研究证实，H9C2 心肌细胞（源于大鼠胚胎的心脏组织）因其与原代心肌细胞在心肌肥大过程中有着这几近想同的病理反应，是作为研究心肌细胞肥大的理想模型。异丙肾上腺素（ISO）是一种非选择性β受体激动剂，能够激活心肌细胞的β1受体从而加快心率和心脏传导，导致心肌细胞肥大。基于以上调查，在本研究中我们拟建立异丙肾上腺素诱导的 H9C2 心肌细胞肥大模型，并且评估该模型中细胞肥大与 NKA活性、NCX活性以及NKAα1和NKA 2表达的关系，同时探索Klotho从NKA活性、NCX活性和NKAα1、NKAα2的表达方面抑制异丙肾上腺素诱导H9C2细胞肥大的机制。　　实验目的：　　1.建立异丙肾上腺素诱导的H9C2心肌细胞肥大模型。　　2.以NKA活性和反向模式NCX活性为切入点探索异丙肾上腺素诱导的H9C2心肌细胞肥大反应的机制。　　3、以NKA活性和反向模式NCX活性为切入点探讨klotho蛋白抑制异丙肾上腺素诱导的H9C2心肌细胞肥大反应的机制。　　实验方法：　　第一部分 异丙肾上腺素诱导H9C2心肌细胞肥大模型的建立　　1.造模　　H9C2细胞随机分为两组，一组给与10μM的异丙肾上腺素，另一组给与相同剂量的生理盐水，37℃/5%CO2条件下孵育12、24、48小时，通过比较对照组与异丙肾上腺素处理组的形态学、细胞膜内Ca2+水平、细胞肥大因子BNP、ANF、β-MHC水平判断是否造模成功。　　2. 形态学表征　　将H9C2细胞用DAPI染料染色，激光共聚焦显微镜观察两组细胞的形态学差异，初步判断异丙肾上腺素组的细胞是否肥大。　　3.细胞膜内Ca2+水平测定　　消化H9C2细胞并计数，取96孔板并以30000个/孔铺板。孵育过夜后小心倒掉培养基，Krebs-HEPES缓冲液洗三次，加入4μM Fura-2/AM和 0.02% pluronic F-127，37℃/5%CO2条件下孵育30分钟，小心倒掉孔板内的液体，加入Krebs-HEPES缓冲液室温平衡20分钟，酶标仪测定Ca2+水平。记录340nm处的激发波长与380nm处的激发波长并其比值（F340/F380）表示Ca2+水平。　　4.细胞肥大因子BNP、ANF、β-MHC表达水平的测定　　使用RNeasy Kit试剂盒提取H9C2细胞中的总RNA，并用上标Ⅲ第一链合成系统将500 ng的模板RNA逆转录为cDNA，扩增后使用steponeplus实时PCR系统对肥大基因进行检测，并用熔体曲线分析证实样品中扩增产物的特异性。　　第二部分：异丙肾上腺素诱导的H9C2细胞肥大机制探究　　1. NKAα1和NKAα2的表达　　试剂盒提取细胞总蛋白后对蛋白进行定量，SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳后转膜，用增强化学发光检测试剂对膜进行免疫反应，并用凝胶成像系统使其可视化。ImagLab软件分析条带灰度值并进行数据统计和分析。　　2. NKA活性测定　　我们通过实验中是否加入哇巴因测量心肌细胞ATP的磷酸生成量来评价NKA的活性。将H9C2细胞消化后在一种混合液中的均匀化，然后通过离心使纯化的膜组分分离。然后将纯化的膜组平均分为两管，在管中分别加入两个不同的缓冲体系， 37℃条件下孵育20分钟使其达到最佳反应温度，然后加入ATP在37℃条件下反应5分钟，加入三氯乙酸停止反应。样品放置在冰上1小时后离心沉淀蛋白质。钼酸铵分光光度法测定上清液中两个样品含量，其差值表示NKA活性。　　3.反向模式NCX活性测定　　我们通过测量无Na+溶液处理后[Ca2+]i的改变来测定反向模式NCX的活性。消化并收集H9C2细胞，在Tyrode溶液中加入兰尼定和烟露蛋白处理5分钟以阻断其内质网功能，然后将细胞与无Na+的Tyrode溶液孵育3分钟，再使用正常Tyrod溶液进行灌注,按照前述方法测定[Ca2+]i。　　第三部分：Klotho蛋白抑制异丙肾上腺素诱导的H9C2细胞肥大反应的机制研究　　在此部分中我们将H9C2细胞分为两组：Control组合ISO处理组。每组又分为四个小组：空白组、Klotho组、Klotho + Control siRNA组、Klotho+ NKAα2 siRNA组。　　1. Klotho蛋白处理　　消化并收集H9C2细胞，铺于6孔板中，其中分散细胞的培养基为特制的含有1μg/mL Klotho蛋白的DMEM高糖培养基，37℃/5% CO2条件下孵育备用。　　2. NKAα2 siRNA和Control siRNA的转染　　购买NKAα2 siRNA和ControlsiRNA，心肌细胞按同种浓度接种，分别加入50 nm NKAα2 siRNA或50 nm Control siRNA，然后在H9c2细胞中加入用脂质体2000并转染， 37?C/5% CO2条件下培养。Western blot分析评估NKAα2的基因沉默效果。　　3. Klotho蛋白抑制异丙肾上腺素诱导的H9C2细胞肥大反应机制探索　　我们通过检测[Ca2+]i水平、细胞肥厚的基因（BNP，ANF，β-MHC）的表达，NKAα1和NKAα2、NKA、NCX的表达活性来探讨klotho蛋白抑制异丙肾上腺素诱导的H9C2细胞肥大反应机制。　　实验结果：　　第一部分　　1.通过对比两组中细胞激光共聚焦的图片分析各组细胞特征发现，H9C2细胞由原来的长梭形变为椭圆形，细胞质的荧光强度也变得更强。　　2. 10μM异丙肾上腺素处理后，H9C2细胞膜上的钙离子过载。　　3.细胞肥大因子BNP、ANF、β-MHC过表达。　　第二部分　　1.异丙肾上腺素处理后NKAα1的表达增加，且其增加情况与异丙肾上腺素处理的时间正相关。　　2.异丙肾上腺素处理后H9C2细胞中的NKAα2的表达减少，孵育时间越长，NKAα2的表达越少。　　3.异丙肾上腺素处理后H9C2细胞中的NKA活性降低，孵育时间越长，NKA的活性越低。　　4. 异丙肾上腺素处理H9C2细胞后，反向模式NCX的活性增加，且其增加的情况与孵育时间正相关。　　第三部分　　1. Klotho蛋白干预异丙肾上腺素诱导的H9C2细胞肥大以后，NKAα1的表达情况没有任何改变。　　2. Klotho蛋白干预异丙肾上腺素诱导的H9C2细胞肥大以后，NKAα2的表达增加，且NKAα2 siRNA的转染能够抑制Klotho蛋白增加异丙肾上腺素诱导的H9C2细胞肥大中NKAα2表达的情况。　　3. Klotho蛋白干预异丙肾上腺素诱导的H9C2细胞肥大以后，NKA的活性增加。　　4. Klotho蛋白干预异丙肾上腺素诱导的H9C2细胞肥大以后，反向模式NCX的活性降低。　　5. Klotho蛋白干预异丙肾上腺素诱导的H9C2细胞肥大以后，[Ca2+]i水平降低，且NKAα2 siRNA的转染能够抑制Klotho对肥大H9C2降低[Ca2+]i水平的作用。　　6. Klotho蛋白干预肥大的H9C2细胞后，细胞肥大因子BNP、ANF、β-MHC的表达降低，且NKAα2 siRNA的转染能够抑制Klotho对肥大H9C2细胞降低细胞肥大因子表达的作用。　　结论：　　1.我们成功建立了异丙肾上腺素诱导的H9C2心肌细胞肥大模型。　　2.异丙肾上腺素诱导的H9C2心肌细胞肥大模型机制与NKAα1上调和NKAα2下调有关，也与NKA活性降低以及NCX活性增加有关。　　3.Klotho蛋白能够通过上调NKAα2的表达抑制异丙肾上腺素诱导的H9C2心肌细胞肥大反应。　　4.Klotho蛋白能够通过上调NCX活性和下调NKA活性抑制异丙肾上腺素诱导的H9C2心肌细胞肥大反应。　　5.Klotho蛋白能够抑制异丙肾上腺素诱导的H9C2细胞肥大引起的[Ca2+]i升高、细胞肥大因子表达增加的情况。