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本文主要从以下几方面展开论述： 第一部分 急性髓系白血病患者DR4基因甲基化水平与DR4mRNA表达水平的研究 目的： 检测AML患者骨髓单个核细胞DR4基因启动子的甲基化水平与DR4mRNA的表达水平,结合临床AML患者的病例资料,研究DR4基因启动子甲基化水平与DR4mRNA的表达水平的相关性,并探讨DR4基因启动子甲基化水平与AML患者临床病理特征的相关性. 方法： 1、甲基化特异性PCR(MS-PCR)检测122例初诊AML患者和24例缺铁性贫血(IDA)患者骨髓单个核细胞DR4基因启动子的甲基化情况; 2、Q-RT-PCR检测此122例患者DR4mRNA的表达情况; 3、对此122例AML患者DR4基因甲基化水平和DR4mRNA水平做相关性分析. 4、对此122例AML患者DR4基因启动子甲基化水平与AML患者临床病理特征做相关性分析. 结果： 1、在122例AML患者中,111例(90.9%)DR4基因启动子区域甲基化阳性,在24例IDA患者中,3例(12.5%)患者该基因启动子区域甲基化阳性,两组比较有显著差异(P=0.002). 2、Q-RT-PCR检测了122例初诊AML患者骨髓单个核细胞DR4mRNA的表达情况,结果显示18例(14.8%)患者该基因mRNA表达阳性. 3、122例AML患者的DR4基因甲基化水平与DR4mRNA水平呈明显负相关(P<0.01). 4、肝脾淋巴结肿大阳性患者组的DR4甲基化水平较阴性组患者偏低(P=0.01),临床分期高危组患者的DR4甲基化水平较低危组患者偏低(P=0.006),一个疗程诱导化疗后未达到完全缓解(CR)的患者组的DR4甲基化水平较达到CR组患者偏低(P=0.03). 小结： 1、AML患者中DR4基因启动子呈高甲基化状态,且甲基化水平与DR4mRNA水平呈负相关; 2、DR4基因甲基化水平在临床分期较晚的AML患者中降低. 第二部分 白血病细胞DR4基因甲基化与TRAIL敏感性的相关性研究 目的： 探讨DR4基因启动子甲基化水平与K562细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)敏感性之间的相关性. 方法： 1、实验组分为TRAIL组(未经地西他滨处理)和地西他滨+TRAIL组(5μmol/L地西他滨+TRAIL),选取未经地西他滨处理和5μmol/L地西他滨处理48h后的K562细胞,分别加入不同浓度(15.625、31.25、62.5、125、250、500μg/ml)的TRAIL,采用CCK-8法检测细胞增殖抑制率; 2、选取未经地西他滨处理和5μmol/L地西他滨处理的K562细胞,加入125μmol/L TRAIL处理48h后,用流式细胞仪检测细胞凋亡率; 3、采用Q-RT-PCR法检测地西他滨处理前后K562细胞DR4mRNA的表达. 4、采用免疫印迹法分别检测地西他滨处理前后K562细胞DR4蛋白的表达. 5、采用甲基化特异性PCR(MSP)检测地西他滨处理前后K562细胞DR4基因启动子区甲基化状态 结果： 1、K562对少量的TRAIL呈现耐受性,增加TRAIL的剂量(其浓度分别为15.625、31.25、62.5、125、250、500μg/ml),反应24/48h后,细胞生长受到不同程度抑制,且呈时间和剂量依赖性; 2、经5μmol/L地西他滨处理48h后,TRAIL对K562细胞的增值抑制作用均较处理前显著增强(P<0.05); 3、经5μmol/L地西他滨处理48h后,125μmol/L TRAIL诱导K562细胞的凋亡率较处理前明显升高(P<0.05); 4、K562可少量表达DR4mRNA和相关蛋白,并且伴有基因启动子的高度甲基化; 5、给予K562细胞一定剂量的地西他滨,得出DR4mRNA含量明显增多(P<0.05). 6、经地西他滨处理后,K562细胞中DR4蛋白的表达显著升高(P<0.05). 7、经地西他滨处理后,K562细胞中DR4基因启动子处于非甲基化状态. 小结： 地西他滨能够有效调节DR4基因启动子的甲基化,增加DR4的含量,加快TRAIL促进K562细胞凋亡的速率,最终有效控制TRAIL的耐药水平. 第三部分 死亡受体DR4/DR5的膜转运水平在白血病细胞TRAIL耐受中的作用及其机制研究 目的： 验证两种急性白血病细胞K562与U937对TRAIL敏感性的差异,分析K562与U937细胞死亡受体的表达水平与TRAIL敏感性的关系,探讨DR4的基因表达抑制对K562细胞TRAIL敏感性的影响,检测两种白血病细胞TRAIL所诱导的死亡受体向膜脂筏区重分布水平的差异,验证死亡受体向膜脂筏区聚集的功能与白血病细胞的TRAIL敏感性有关. 方法： 1、MTT法分别检测TRAIL对K562与U937细胞的药物毒性,流式细胞学方法检测TRAIL所诱导的细胞凋亡水平; 2、RT-PCR与western blot法分别检测K562与U937细胞中死亡受体DR4与DR5的表达水平; 3、根据DR4序列涉及相应的siRNA,转染至K562细胞内,RT-PCR与western blot验证DR4的基因表达抑制; 4、MTT法与流式细胞学方法分别检测DR4基因表达抑制的K562细胞的TRAIL敏感性; 5、免疫荧光染色结合流式细胞术检测TRAIL所诱导的死亡受体膜聚集水平; 6、密度梯度超速离心法分离脂筏与非脂筏成分后,通过western blot检测TRAIL所诱导的DR4、DR5和pro-caspase8在两种白血病细胞中向脂筏区重分布水平的差异; 7、制霉菌素预处理TRAIL敏感的U937细胞,干扰其脂筏功能,反向验证死亡受体向膜脂筏区转运的功能与TRAIL敏感性相关. 结果： 1、MTT法与流式细胞学方法验证了K562为原发性TRAIL耐受的白血病细胞,U937为TRAIL敏感的白血病细胞; 2、RT-PCR与western blot检测发现：两种细胞的DR5表达水平相似,原发性TRAIL耐受的K562细胞反而具有更高的DR4表达水平; 3、DR4-siRNA的转染成功抑制了K562细胞的DR4基因的表达,但MTT与流式细胞学结果显示：DR4基因的表达抑制对K562的TRAIL敏感性并未产生明显影响; 4、免疫荧光染色结合流式细胞术发现：随着TRAIL诱导时间的延长,U937细胞膜表面含TRAIL的免疫复合物水平明显升高,而K562细胞无类似现象; 5、密度梯度超速离心法分离脂筏与非脂筏成分后,caveolin-1被检测位于条带4、5处,证实该处为脂筏所在的位置,U937细胞经TRAIL处理后,死亡受体DR4、DR5及pro-caspase8向脂筏区移动,而K562细胞无此趋势; 6、制霉菌素有效地抑制了死亡受体向膜脂筏聚集,导致了原来敏感的U937细胞对TRAIL所诱导的凋亡水平明显下降. 小结： 1、急性白血病细胞K562细胞为TRAIL原发性耐受细胞,U937细胞为TRAIL敏感细胞; 2、死亡受体的表达水平与白血病细胞的TRAIL敏感性无明显正相关,且DR4的表达水平在K562细胞的TRAIL原发性耐受中无关键作用; 3、TRAIL所诱导的死亡受体向膜脂筏区的转运调节功能与白血病细胞的TRAIL敏感性密切相关,K562细胞的原发性TRAIL耐受可能与死亡受体向脂筏区重分布的功能缺陷有关.