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视网膜中的神经胶质细胞主要有视网膜所特有的müller细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞,但主要的胶质细胞是müller细胞,星形胶质细胞和小胶质细胞占很小一部分。müller细胞自外界膜纵向伸展,穿过整个视网膜至内界膜,其胞体在内核层。它除有一般的支持和营养作用外,在保持视网膜内环境稳定中担任了重要角色,起着星形胶质细胞和少突胶质细胞的共同功能。随着对müller细胞研究的不断深入,许多眼底疾病包括增殖性玻璃体视网膜病变(proliferativevitreoretinopathy,PVR)的发生机制取得重大进展。因此,müller细胞在视网膜疾病中具有举足轻重的作用。
虽然PVR的手术治疗已经非常成熟,但是许多视网膜手术医生都希望能用药物预防PVR的发生和复发。全反式视黄酸(all-transretinoicacid,RA)是维生素A在体内的自然衍生物,对许多高等动物的正常发育具有非常重要的作用,发挥诱导分化、抑制增殖、促进凋亡等作用。本研究将RA作用于müller细胞,通过形态学观察和现代分子生物学技术探讨RA抑制müller细胞增殖、促进其凋亡的有效作用浓度和作用时间,并试图通过RA对müller细胞MAPK信号通路的影响阐述其作用机制。
1目的:观察RA对体外培养的müller细胞生长的效应及其有效作用浓度和作用时间,以及对其细胞周期和MAPK信号通路的影响。
2方法:2.1细胞培养复苏人müller细胞株一支,用含10%新生小牛血清的DMEM/F12培养基在37℃含5%CO2的培养箱中培养。当细胞生长并达到80%融合时,用0.05%胰酶消化吹打制成单细胞悬液并传代,供后续实验使用。
2.2RA的制备将RA溶于DMSO配制成10-2M的储存液,使用前用新鲜无血清培养基配制成不同浓度。0.001~100μM范围内RA用于初步观察RA对müller细胞产生作用的数量级范围,并根据以上结果选取较小浓度范围的RA进一步观察müller细胞发生的改变以及其对RA浓度的依赖性。
2.3倒置显微镜下观察müller细胞在RA作用下的形态学改变;
2.4MTT法检测RA对müller细胞的生长抑制作用;
2.5HE染色观察RA作用后凋亡müller细胞的形态改变;
2.6细胞计数法统计RA作用后残留细胞数目;
2.7流式细胞术观察RA作用后müller细胞的凋亡率以及细胞周期的改变;
2.8免疫细胞化学法(Immünocytochemistry,ICC)和/或免疫印迹法(WesternBlot)初步探讨MAPK信号转导通路中ERK、p38、P-SAPK/JNK和ATF2蛋白表达的变化;
2.9采用SPSS12.0软件进行统计分析,KONTRONIBAS2.0全自动图像分析系统对扫描条带半定量分析。
3结果:3.1müller细胞形态学改变所有对照组müller细胞大小均匀,呈细长形或多角形,有些细胞呈鱼贯状相连。RA的浓度为0.001μM、0.01μM、0.1μM时müller细胞的形态和对照组相比基本无变化;RA浓度增加到1.0μM时,细胞间距增大,脱落的细胞开始增多;当RA浓度的浓度达到10μM时,细胞数目明显减少,脱落细胞明显增加,并且48h较24h变化更明显。
3.2MTT法结果显示低浓度RA(0.001μM、0.01μM、0.1μM)抑制作用不明显(p>0.05),高浓度RA(1.0μM、10μM、100μM)则抑制作用显著(p<0.05)。RA浓度为5μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM均对müller细胞有明显的抑制作用(p<0.05),作用时间为48h时,半数抑制浓度(IC50)为18.72μM,RA对müller细胞的抑制作用表现出时间和浓度依赖性。
3.3HE染色HE染色结果显示,细胞发生改变的程度及数目存在着时间和浓度依赖性,20μM的RA作用48h时变化最明显,可见胞浆浓缩,胞核固缩、碎裂、染色变成深蓝色。
3.4细胞计数结果20μM的RA作用48h后细胞数目(2.46×106个)较对照组(4.50×106个)明显减少(p<0.01),其余组细胞数无明显改变(p>0.05)。
3.5流式细胞术检测结果3.5.1凋亡结果不同浓度的RA(5μM、10μM、20μM)均可诱导müller细胞凋亡,凋亡率呈浓度和时间依赖性,20μM的RA作用48h时细胞凋亡率最高,凋亡指数为35.87±7.40%(p<0.01)。
3.5.2细胞周期RA浓度为20μM并作用48h时,G2期细胞数目百分比明显减少,为0.40±0.69%,且与对照组相比差异显著(p<0.01),其它组各期细胞数目百分比与对照组比较则均无显著性差异(p>0.05)。
3.6MAPK信号转导通路的改变3.6.1免疫细胞化学结果10μM的RA作用于müller细胞24h后,p38蛋白表达较对照组减少,胞浆内棕色颗粒较少,染色较浅;而ERK1/2(p44/42)蛋白的表达较对照组未见改变。
3.6.2免疫印迹结果ERK1/2(p44/42)蛋白的表达在实验组未见改变(实验组/对照组=1.04±0.07),而p38蛋白的表达在实验组则减少(实验组/对照组=0.62±0.09)。P-SAPK/JNK和ATF2的蛋白表达明显增加,实验组与对照组的比值分别为2.30和3.78。
4结论:4.1适当浓度的RA能使müller细胞的形态发生改变;
4.2RA能抑制müller细胞的增殖、促进其凋亡,并具有浓度和时间依赖性;
4.3RA对müller细胞的细胞周期影响不大,只有在20μM的RA作用48h时,RA才表现出G2期细胞数目明显减少,推测其可将细胞周期阻断于S期。
4.4RA对müller细胞的作用与p38和JNK信号通路有关,与ERK通路无关。