脊髓损伤(SCI)是脊柱损伤最严重的并发症,是一种严重的神经系统功能障碍性疾病,损伤后会导致损伤节段以下肢体发生严重的功能障碍,最典型的表现为损伤部位以下瘫痪,这不仅会给损伤患者本人带来严重的身心伤害,还会给家庭和社会带来沉重的经济、心理负担。随着现代社会经济的快速发展,尤其交通事故、工程建设和自然灾害等各类创伤的发病率上升,呈现致伤因子高能量、瞬间作用于人体,造成多部位和多脏器损伤的特点,脊髓损伤发生率出现逐年增高的趋势,尽管国内外关于SCI的基础、临床研究众多,但如何对脊髓损伤进行有效的预防和治疗已经成为当今医学界的一大难题。由于中枢神经系统的再生能力很低,因此SCI导致永久性瘫痪的风险很大。并且SCI的病理生理学是十分复杂的,脊髓损伤后的轴突再生和功能恢复,主要与脊髓损伤后微环境中神经营养因子、髓磷脂相关抑制因子以及瘢痕形成有密切关系。主要涉及组织损伤的原发性损伤和继发性损伤机制。继发性损伤的机制主要包括炎症、瘢痕形成和轴突变性。其中,脊髓损伤后瘢痕形成对阻碍轴突的再生、进而影响功能恢复起到主要的作用。瘢痕的形成是一系列的、动态的复杂过程,按照形成机制和时间主要分为胶质瘢痕和纤维瘢痕两类。早期星形胶质细胞增生肥大,与炎性病变核分离,形成所谓的胶质瘢痕,早期星形胶质细胞增多等可能对轴突再生具有一定有利的影响。第二种类型的瘢痕,称为纤维瘢痕,主要是由病变部位的脊膜和毛细血管的内皮细胞及成纤维细胞构成。胶质瘢痕在脊髓损伤后早期出现,我们的前期实验已经证实:在体外实验中,利用TGF-β1刺激星形胶质细胞可使其转化为反应性星型胶质细胞,增生肥大,分泌促神经生长因子,限制炎症扩散对神经再生起到促进作用。在损伤后7天左右,成纤维细胞由损伤区域临近的硬脊膜和血管周围细胞中的入侵,而后激活、增生肥大,最终形成纤维瘢痕。其对突触再生和功能恢复起着机械屏障和生物抑制作用:(1)活动性增生肥大且分泌细胞外基质,包括:ⅣV型胶原、纤维连接蛋白和层粘连蛋白等,形成阻碍突触生长的机械屏障;(2)分泌多种的突触生长抑制分子:NG2蛋白聚糖、肌腱蛋白C、semaphorin 3A和EphB2等,形成了阻碍功能恢复的生物障碍。在损伤后14天左右,纤维瘢痕与胶质瘢痕之间会形成一层胶质界膜,严重阻碍突触再生和功能恢复。已有研究证实,通过抑制脊髓损伤后纤维瘢痕的形成,可以为突触再生创造良好的环境,但这些方法均未对功能恢复起到很好的作用,并且传统的治疗方式同样不理想。因此我们在不妨碍早期胶质瘢痕有益作用的情况下,找到一种方法,如何抑制脊髓损伤后成纤维细胞的激活、纤维化的发生发展和纤维瘢痕的形成,抑制纤维化疤痕的形成,从而降低瘢痕形成后的不良影响,这可以作为促进轴突再生的潜在方法。microRNAs(miRs)是一类进化上非常保守,长度介于21～25nt的非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)单链小分子,它能够通过降解靶基因mRNA或者抑制其翻译过程,达到负向调控目的蛋白的作用。miRs在不同生物体内与靶标结合的方式不尽相同,而且通常可与多种蛋白相互作用。这种复杂的调节网络既可以通过一个miR来调控多个基因的表达,也可以联合几个miRs来精细调控某个基因的表达。miRs的这种特性决定了其可以同时调节多种靶蛋白,进而调控细胞的功能变化。近期研究发现揭示了 microRNA-21(miR-21)在心脏、肺、肾脏和肝脏纤维化瘢痕形成中的作用,我们前期的研究表明,miR-21在损伤部位高表达,且表达呈上升趋势。因此,我们推测miR-21可能是纤维化的一个新的潜在分子靶点。我们认为miR-21作为调节纤维化的重要调节因素,通过在不同时间干预miR-21 的表达量既能够充分发挥胶质瘢痕的有益作用,又能抑制纤维瘢痕的不利影响,将会有利于神经再生和功能恢复,但其调控原理机制、时间节点仍需要进一步的研究证明。对此我们提出以下亟待解决的问题:1)通过调控miR-21的表达量是否可以调控成纤维细胞激活、分化、增值、分泌等过程?2)建立脊髓损伤模型后,通过在不同时间调控miR-21的表达量能否达到最好治疗效果?及治疗节点时间?我们拟建立脊髓损伤模型,通过动物、组织、细胞、分子等水平重点研究miR-21通过通路调控成纤维细胞激活等功能、纤维瘢痕形成的作用机制和发挥作用的下游功能靶标。成功构建脊髓损伤的动物模型对于治疗脊髓损伤具有重要的临床意义,并且有利于对脊髓损伤机制的深入探究。实验室制作脊髓损伤模型常见的分为三大类,分别是挤压伤或挫伤模型、完全横断和局部离断模型、缺血损伤和化学损伤模型。当前脊髓损伤鼠模型的造模方式主要包括重物坠落法、脊髓压迫法以及钳夹法等,其中重物坠落法主要造模装置有标准Allen’s打击造模装置和精密打击造模装置。自1911年Allen首次运用重物自由落体原理实施垂直打击脊髓来制作SCI模型以来,由此而产生的重物打击脊髓仪器逐渐更新换代,利用上述原理,本课题组主要采用了先进的改良标准Allen’s打击造模装置制作的动物模型,具有手术操作简单、创伤小、易控制,且实验耗材便宜易得、一致性与相容性好,观察及评价便利,是理想的脊髓损伤的小鼠模型。本实验室通过采用标准Allen’s打击造模装置制作了动物模型,运用BMS标准评分评估术后小鼠运动功能的恢复。且取损伤组织使用H&E染色等方法,从形态学分析了小鼠脊髓损伤动物模型构建的效果。结果显示损伤组小鼠术后运动功能受损,组织切片见对照组神经形态均为正常,而与对照组相比,SCI组小鼠脊髓结构的完整性则受到严重地损害,并且在挫伤部位出现了明显的组织压迫,从而提示我们成功构建了 C57/BL6小鼠脊髓损伤的动物模型。本研究主要采用小鼠模型,评估敲除microRNA-21(miR-21KD)来治疗急性胸脊髓挫伤的疗效。我们将40只C57/BL6小鼠随机分为4组:假手术组(Sham)小鼠接受无脊髓挫伤的手术治疗;脊髓损伤(SCI)组小鼠脊髓挫伤后未经手术治疗处理;miR-21 KD组小鼠接受脊髓损伤处理后,进行单次剂量硬膜下注入miR-21 KD病毒载体(1×107TU);和阴性对照(NC)组小鼠在脊髓损伤处理后,接受硬膜下注射等量的NC病毒载体(1×107TU)。本研究采用Basso Mouse Scale(BMS)评估小鼠后肢运动功能。采用苏木素-伊红和Luxol快速蓝染色观察脊髓组织的病理改变。运用酶联免疫吸附试验来测定外周血中血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子β(TGF-β)和白介素-1β(IL-1β)的水平。通过采用RT-PCR来检测脑衍生神经营养因子(BDNF)的mRNA水平的表达。与SCI组相比,miRNA-21的敲除(miR-21 KD)组,损伤处理后第14天有效提高了 BMS的评分(p<0.01)。并且miR-21 KD组的脊髓组织在损伤后第14天,神经元形态显示出最明显的恢复迹象。与其他对照组相比,miR-21抑制组血清内的TGF-β1、TNF-α和IL-1ββ表达水平都明显降低,而脑源性神经营养因子(BDNF)的基因表达在miR-21敲除后,明显上调(p<0.01)。近期研究表明PTEN/PI3K/AKT信号通路在纤维瘢痕形成的过程中,miR-21也发挥了一定的调控作用。因此经以上研究结果推测,miR-21可能是调节脊髓损伤后瘢痕形成和促进神经功能恢复的有效靶点。为了探究AKT通路是否参与了 miR-21在脊髓损伤后纤维化瘢痕形成的过程,我们对不同处理的样品中磷酸化AKT活性和p-AKT/总AKT比值进行了半定量检测。结果显示损伤后脊髓组织中AKT磷酸化水平升高,miR-21抑制后AKT磷酸化水平明显降低。这提示了 AKT通路可能至少参与了 SCI中与miR-21相关的创伤后反应。结合上述数据表明,在脊髓损伤后抑制miR-21水平可以减少炎症反应,增强运动功能恢复。经过进一步的研究我们阐明了 miR-21与SCI后AKT信号通路的关系,miR-21在炎症细胞因子变化和脊髓损伤后瘢痕形成中的作用,以及miR-21用于相关临床治疗的可行性,从而为脊髓损伤的治疗提供一个新的治疗靶点。