目的:深静脉血栓(deep venous thrombosis,DVT)是血液在深静脉内异常凝结形成血栓引起的静脉回流障碍性疾病,血栓脱落可引起肺动脉栓塞(pulmonary embolism,PE)。两者在形成过程、发病机制及治疗上颇为相似,常将两者合称为静脉血栓栓塞症(venous thromboembolism,VTE)。VTE发病率仅次于急性冠状动脉综合征和脑卒中,其危害范围广而严重。据统计,血栓栓塞致死案件约占法医病理学鉴定案例死亡原因的5%。临床上常根据血液学、影像学等手段来诊断肺栓塞;而法医检案过程中遇到的致命性肺栓塞案例,通过尸体解剖肉眼可见明显肺动脉血栓及下肢深静脉(通常是腘静脉)血栓形成,并结合常规法医病理学检验技术对此作出鉴定。但VTE的发生常见于创伤、制动等存在的前提下,法医鉴定时需阐明创伤与肺栓塞之间是否存在因果关系,若涉及多项危险因素并存,需阐明这些因素参与程度的大小即伤病参与度,血栓形成时间、及其与创伤存在时间上的先后、血栓来源等问题。目前关于血栓形成时间推断尚缺乏系统研究,在法医鉴定时也缺乏有效指标和统一标准。而血栓形成时间推断研究对解决上述法医鉴定问题具有现实意义。本实验在建立大鼠下腔静脉血栓形成模型的基础上,结合该类案件法医鉴定的组织标本,采用HE染色、Von Kossa染色、Perl’s染色、Masson三色法染色及免疫组织化学染色方法,对血栓形成部位的组织病理学改变进行动态观察,研究血小板膜糖蛋白-Ⅲa(CD61)、平滑肌动蛋白(α-SMA)、CD34在血栓形成不同时间点的变化规律,以期为血栓形成时间推断的法医学鉴定提供科学依据。方法:1动物实验:大鼠下腔静脉血栓HE染色、Von Kossa染色、Perl’s染色、Masson染色和免疫组织化学染色。实验分组:健康清洁级Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠80只,体重250g±10g,适应环境饲养1周,按完全随机分组方法随机分为下腔静脉狭窄术后0h、3h、6h、12h、1d、3d、1w、2w、3w和4w等10组,每组8只。建立下腔静脉“狭窄法”动物实验模型,按上述分组时间点麻醉大鼠进行下腔静脉取材,取材后立即放入10%中性甲醛中固定,对血栓形成部位进行he染色、vonkossa染色、perl’s染色及masson染色,应用免疫组织化学染色方法观察血栓形成过程中各组cd61、α-sma、cd34表达的变化。2人组织标本实验:回顾性分析河北医科大学法医鉴定中心肺栓塞死亡案例,对下肢深静脉及肺动脉血栓部位石蜡包埋组织块切片后进行he染色及cd61、α-sma、cd34免疫组织化学染色,观察其组织病理学形态变化及上述蛋白的表达变化,分析血栓形成时间与创伤时间的关系。数据以“均数±标准差(mean±sd)”表示,用spss21.0统计软件进行统计学分析,各组均数的比较行单因素方差分析(anova),用最小显著差法(leastsignificantdifference,lsd)作两两比较,以p<0.05为有显著统计学差异。结果:1动物实验1.1下腔静脉血栓染色1.1.1下腔静脉血栓he染色0h组血管内淤血样改变;3h组、6h组管腔内部附壁白色血栓形成,并向血管腔延伸,其间可见少许纤维素样成分析出,中性粒细胞开始增多;12h组血小板小梁大量形成并聚集成片状,至1d组达其峰值,小梁间充满红白细胞;3d组血栓与管壁接触面可见成纤维细胞;1w-3w组血栓收缩,内部出现裂隙,裂隙表面可见内皮细胞,新生血管形成,血栓增生样改变,管壁紧密黏着的血栓开始机化,大量纤维成分由黏着部位向血栓内部浸润生长,单核细胞胞核增大,含铁血黄素渗出,巨噬细胞体积增大数量增多,钙盐形成,二次狭窄管腔可见少量新生白色血栓;4w组血管内膜增生样改变,血栓被机化组织取代,血管再通。1.1.2下腔静脉血栓perl’s染色perl’s染色可将含铁血黄素颗粒染成蓝色。本实验发现含铁血黄素颗粒最早见于建模3d组,其散落于血栓内部;1w-3w组含铁血黄素含量迅速增多,且常位于与血管壁粘连的血栓边缘部位,但血栓内部亦可见,3组间比较无明显差异;4w组机化的血栓组织中含铁血黄素颗粒大量沉积,与各组间比较有明显差异(p<0.05)。1.1.3下腔静脉血栓vonkossa染色vankossa氏银染色法(vk染色)可将钙盐沉积染成黑色。1w-2w组钙盐沉积散在分布于机化的血栓组织的边缘部位,两组比较无明显差异;随着建模时间的延长,3w、4w组包含大量钙盐的异物巨噬细胞体积增大数量增多,未经吸收的钙盐直接存在于血栓组织中,钙化形成静脉石。随时间延长各组钙盐沉积量呈增多趋势。3w、4w组分别与各组比较有明显差异(p<0.05)。1.1.4下腔静脉血栓masson染色masson染色可将胶原纤维、粘液染呈绿色,胞浆、肌肉、纤维素呈红色、胞核呈清晰黑蓝色。1-3d组血栓内胶原沉积区域较少;随建模时间延长,胶原沉积由血栓边缘部逐渐向血栓内部蔓延,至4w组可见大量胶原沉积,充满整个管腔。3d、1w和2w各组间比较无明显差异,3w、4w组与各组比较有明显差异(p<0.05)。1.2下腔静脉血栓免疫组织化学染色1.2.1下腔静脉血栓cd61免疫组织化学染色3h组血栓形成部位散在表达;6h组靠近管壁的层状血小板小梁内表达;至1d组达到表达峰值,3d、1w组cd61表达显著下降;2-4w组仅在二次狭窄的管腔内血栓再形成部位表达。1d组与各组比较差异明显(p<0.05);1.2.2下腔静脉血栓α-sma免疫组织化学染色α-sma为平滑肌动蛋白,在血栓机化过程中表达于成纤维细胞。本实验在3d组内血栓的边缘发现少许α-sma的阳性表达;1w组达到表达高峰,2-4w组仅在部分新生成的毛细血管壁内表达,1w组与各组比较有明显差异(p<0.05)。1.2.3下腔静脉血栓cd34免疫组织化学染色cd34为血管内皮特异性标记物,本实验发现cd34最早于3d组靠近管壁部位的血栓内散在表达;1w组新生血管形成增加,cd34表达占原血管腔面积的7%;2-4w组新生血管密集融合,4w组cd34表达面积可达原血管腔面积的22.8%,其内可见红细胞成分。3d组与1w组比较无明显差异,4w组与3d和1w组比较有明显差异(p<0.05),2w、3w、4w间相互比较无明显差异。2人体组织实验2.1深静脉血栓he染色早期血栓血小板黏附聚集于管壁裸露胶原,附壁血栓形成混合血栓头部,纤维素渗出;随后血小板大量聚集,进而进展形成大量血小板小梁,小梁网络红白细胞、纤维素形成网状结构,交替形成混合血栓。混合血栓逐渐增大阻塞管腔,红细胞聚集形成血栓尾部。血栓形成晚期内皮细胞、纤维母细胞向血栓内部生长,血栓开始机化,较大血栓收缩内部出现裂隙内皮细胞附于表面,新鲜毛细血管形成,进而融合成较大管腔血管,血管再通;血栓脱落可形成肺栓塞。2.2静脉血栓免疫组织化学染色肺动脉CD61片状表达(创伤骨折23天死亡案例);腘静脉血栓形成部位边缘α-SMA阳性表达(骨折31天死亡案例);腘静脉形成血栓内部CD34大量表达(骨折43天死亡案例)。结论:1大鼠模型静脉血栓特殊染色(VK染色、Perl’s染色、Masson染色)和免疫组织化学染色(CD61、α-SMA、CD34)均发现血栓形成不同时间分期的变化特点:CD61可用于血栓形成超早期及血栓再形成时期,Perl’s染色可用于血栓形成中期;而Masson染色和α-SMA则可用于血栓形成中晚期;VK染色及CD34可用于血栓转归过程晚期的时间推断。以上血栓形成不同时间的推断的特异性特点可为法医血栓形成时间推断提供参考依据。2人体组织部分实验表明上述指标方法对于初步探索人体肺栓塞案例血栓形成时间推断的研究有一定意义。