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肾细胞癌（renal cell carcinoma, RCC）简称肾癌，起源于肾实质层泌尿小管上皮系统的泌尿系统中常见的恶性肿瘤之一。肾癌对传统的放化疗均不敏感。生物治疗技术是通过提高机体自身的免疫能力，实现患者自身机体的“自主抗癌”，成为肿瘤治疗领域最受关注的焦点之一。甲壳素和壳聚糖作为研发阶段的生物治疗制剂，近年来愈来愈备受关注。壳聚糖(Chitosan，CTS)是由甲壳素（Chitin，CT）通过脱乙酰制得的一种聚乙酰氨基葡萄糖。甲壳素和壳聚糖经羧基化反应后可分别制得羧甲基甲壳素（CM-CT）和羧甲基壳聚糖(CM-CTS);甲壳素和壳聚糖经水解后可分别制得N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）和壳寡糖（COS）。甲壳素和壳聚糖的各种衍生物均具有良好的水溶性和生物活性，可被机体降解吸收，因而在医药、生物材料、食品等领域得到广泛的研究和应用。甲壳素和壳聚糖对肾癌的影响目前鲜有报道；对机体单核细胞（PBMCs）的影响目前也未见报道。在抗肿瘤的免疫应答中，细胞免疫起主要作用。参与细胞免疫的细胞主要是单核细胞（PBMCs），包括：T淋巴细胞、NK细胞、单核巨噬细胞等。若能促进单核细胞的增殖与分化，必将促进机体的免疫及抗肿瘤作用。本文以CM-CT、CM-CTS、COS、NAG四种甲壳素衍生物为研究对象，观察加糖前后对体外培养的人外周血单核细胞（PBMCs）的增殖分化、凋亡及分泌细胞因子等的影响，进而探讨对机体的免疫系统的影响；同时体内外培养肾肿瘤细胞OS-RC-2，观察糖衍生物对小鼠免疫系统的影响及对肾肿瘤细胞及组织的抑瘤效果及作用机制。主要应用MTT法、AO-EB染色、流式细胞术、Elisa酶联免疫法、RT-PCR和免疫组化、电镜观察等方法和技术探讨了甲壳素衍生物的作用及作用机制。甲壳素衍生物体外培养人外周血PBMCs,MTT和AO/EB结果显示，中、低剂量组的CM-CTS、CM-CT可明显促进其增殖并抑制其凋亡，而COS和NAG在中、高剂量组效果显著（P<0.05）。流式细胞仪结果显示，CM-CT主要使CD3CD56~+亚基的表达显著增高，即主要促进PBMCs中NK细胞的分化，最佳作用剂量为100μg/ml; CM-CTS剂量组可使PBMCs中的CD3CD56~+亚基和CD3~+CD8~+亚基的表达显著提高，表示CM-CTS对NK细胞和Tc细胞的分化均有促进作用，最佳作用剂量为100μg/ml； COS和NAG两剂量组可使PBMCs中的CD3CD56~+亚基和CD3~+CD8~+亚基的表达显著提高，表明二者主要促进Th细胞和NK细胞的分化，最佳作用剂量均为300μg/ml；ELISA结果显示，50μg/ml的CM-CTs和100μg/ml的CM-CT剂量组对PBMCs分泌细胞因子IFN-γ和IL-2均有明显的促进作用；COS在100μg/ml和300μg/ml剂量组时可明显促进IFN-γ和IL-2因子的分泌（P<0.01），而NAG在500μg/ml、300μg/ml时作用效果显著（P<0.01）。体外培养人肾肿瘤细胞OS-RC-2，观察甲壳素衍生物对其影响。MTT和AO-EB结果显示，中、低剂量组的CM-CTS、CM-CT和中、高剂量组的COS和NAG可抑制肾肿瘤细胞OS-RC-2的增殖并促进其凋亡（P<0.05）。流式细胞术结果显示，中、低剂量组的CM-CTS、CM-CT及中、高剂量组的COS和NAG均可使滞留在G0/G1期的癌细胞显著提高，使滞留在S期和G2/M期的癌细胞显著降低，从而阻断癌细胞DNA的合成，导致其凋亡。体内实验结果显示，甲壳素衍生物小鼠灌胃15天后，各实验组中小鼠的体重、胸腺和脾脏指标及抑瘤率均有变化，中、低剂量组的CM-CTS、CM-CT及以及中高剂量组的COS和NAG在有效抑瘤的同时，还对免疫器官起到有效的保护作用。CM-CTS的最佳作用剂量为50mg/kg，抑瘤率为48.03%±1.05%；CM-CT的最佳作用剂量为100mg/kg，抑瘤率为50.78%±1.03%；而COS的最佳作用剂量为100mg/kg，抑瘤率为53.54%±1.11%；NAG则在500mg/kg时抑瘤效果最好，抑瘤率为58.66±1.43%(P<0.01)。RT-PCR和免疫组化结果显示，CM-CTS在50mg/kg时可明显抑制瘤细胞OS-RC-2VEGFmRNA及其蛋白的表达，CM-CT的最佳作用剂量为100mg/kg，而COS和NAG则在300mg/kg时抑制效果明显(P<0.01)。透射电镜结果显示，四种甲壳素衍生物均可引起肿瘤细胞超微结构的改变,其中CM-CT组和NAG组可见明显的核染色质固缩及细胞器结构的改变。小鼠NK细胞杀伤率及血清中IFN-γ及IL-2含量测定结果表明，中、低剂量组的CM-CTS、CM-CT、COS及高、中剂量组的NAG不但可有效提高小鼠NK细胞杀伤率，还可促进血清中IFN-γ及IL-2两种细胞因子的分泌。综上所述，甲壳素衍生物既能直接抑制肾肿瘤细胞OS-RC-2的增殖分化并促进其凋亡，还可通过促进免疫细胞的活化和分化及促进细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌而间接地杀伤肿瘤细胞；其中CM-CT和CM-CTS在中、低剂量组作用效果较好，而COS和NAG在中、高剂量组效果显著；通过数据分析可看出，在对机体的免疫调节及抗肿瘤的免疫应答过程中，NAG的促进作用效果最明显，其后依次是COS,CM-CTS，CM-CT,小分子量的NAG和COS作用效果要优于分子量大的CM-CTS和CM-CT；而在抗肿瘤的研究机制中发现，CM-CT的作用效果要优于CM-CTS, NAG的作用效果要优于COS， NAG的作用效果最佳。甲壳素衍生物作用的最佳浓度与效果的不同，可能与其分子量大小的不同及浓度等因素有关。