酵母双杂交鉴定TCTP与Rheb相互作用关系并验证其功能

来源 :内蒙古大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:studyrec
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
翻译控制肿瘤蛋白(Translationally controlled tumor protein,TC TP)是真核生物中广泛表达的一种保守的蛋白,结构上与Mss4(磷脂酰肌醇激酶)蛋白相似,在维持细胞正常生理功能中起着重要作用。Rheb(Ras homolog enriched inbrain)是Ras超家族的小GTP酶,有Rheb-GDP和Rheb-GTP两种形式,是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路的上游正调控因子,与mTOR信号通路共同调控着细胞生长、增殖和分化等过程。有报道显示TCTP可能是Rheb的鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF),使得Rheb从无活性的GDP形式转换为有活性的GTP形式,但这一功能目前尚不能确定。本研究以内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞(GFb)为材料,探讨TCTP和Rheb之间的相互作用关系,并对TCTP的功能进行初步研究。  实验首先利用RT-PCR克隆绒山羊TCTP基因的cDNA,分析其表达特性;然后利用免疫共沉淀和Western-Blot鉴定免疫沉淀复合物中TCTP和Rheb的共同存在,证明二者的相互作用关系;接着构建TCTP基因和Rheb基因的酵母双杂交诱饵载体和靶载体,转化酵母菌,利用酵母双杂交技术进一步确定二者间的直接作用关系;最后构建TCTP过表达和RNA干扰载体,转染GFb细胞,利用Western-Blot检测总蛋白中mTOR信号通路效应分子mTOR、S6的表达量及磷酸化情况,确定TCTP是否参与了mTOR信号通路的调控,再利用流式细胞术检测细胞周期,明确TCTP是否具有调控细胞周期的功能。  绒山羊TCTP基因ORF全长519 bp,编码172个氨基酸残基,该基因在肝脏中表达量较高,在脑中表达量较低。免疫共沉淀检测到TCTP与Rheb具有相互作用。进一步的酵母双杂交鉴定表明二者具有直接的相互作用。TCTP过表达和转录后沉默TCTP基因显著影响mTOR和S6的表达,但对其磷酸化水平无影响。流式细胞术检测结果显示过表达TCTP对细胞周期没有影响,转录后沉默TCTP基因诱导细胞周期阻滞,表明TCTP可能与细胞周期进程相关。  本研究结果丰富了TCTP基因的遗传信息,证明绒山羊细胞中TCTP与Rheb之间具有相互作用关系,但可能不是Rheb的GEF,其参与mTOR信号通路活性和细胞周期进程调控的机制还有待于进一步研究。
其他文献
Bta-miR-21-5p定位在牛基因组第19号染色体。目前已经发现差异表达的miR-21通过与靶基因相互调控来对细胞的生长、迁移和凋亡等方面起作用。本试验通过高通量测序的方法在转
本文对 微波通信系统的电磁兼容分析软件实现进行了研究。文章在对微波通信系统间的干扰及雷达对微波通信系统的干扰机理进行研究的基础上,利用VisualC++在windows95环境中开
电磁带隙(Electromagnetic Band Gap, EBG)结构是由光子晶体带隙在微波中的应用演变而来的,主要分为传统蘑菇型电磁带隙(Conventional Mushroom Electromagnetic Band Gap, C
光子晶体具有小尺寸、良好的光子局域、便于集成等特性,在光学芯片的实验研究中具有很大的应用前景。采用光子晶体微腔设计的传感器在品质因数、灵敏度、探测极限等方面都具
本实验应用全细胞膜片钳技术,探讨人工合成大麻素WIN55,212-2对大鼠三叉神经节神经元GABA-激活电流(IGABA)的调制作用。结果显示:(1)实验中大部分受检细胞(91.84%)对胞外给予GAB
该文分析了在ISDN用户环路中2B+D接口设计中的理论和思路在此基础上提出了合理的解决方案,对容易混淆的问题加以解释,并着重分析了同步及干扰的问题.
高中学生之间由于存在着客观的差异,导致高中生的物理成绩有高有低,甚至产生了严重的两极分化现象.新课程改革的理念要求全部的高中生都能够获得平等的发展,为了使所有的高中
本文提出了将图象几何特征与奇异值分解相结合的方法来进行特征提取,首先提取出图像的几何特征,然后利用奇异值分解对它们构造代数特征,最后将代数特征用于分类器实现图像识
随着用户业务需求的不断增加,蜂窝移动通信的系统容量面临着越来越大的挑战,而无线频域资源的稀缺使这一问题越来越严重。蜂窝异构网络架构的诞生有效的解决了这一问题:提升了
在《核心素养导向的初中生物实验教学研究》课题组的调查研究过程中,发现本县初中生物学开展实验教学中存在的一些问题,分析其原因,并提出解决问题的相应对策.