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翻译控制肿瘤蛋白(Translationally controlled tumor protein,TC TP)是真核生物中广泛表达的一种保守的蛋白,结构上与Mss4(磷脂酰肌醇激酶)蛋白相似,在维持细胞正常生理功能中起着重要作用。Rheb(Ras homolog enriched inbrain)是Ras超家族的小GTP酶,有Rheb-GDP和Rheb-GTP两种形式,是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路的上游正调控因子,与mTOR信号通路共同调控着细胞生长、增殖和分化等过程。有报道显示TCTP可能是Rheb的鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF),使得Rheb从无活性的GDP形式转换为有活性的GTP形式,但这一功能目前尚不能确定。本研究以内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞(GFb)为材料,探讨TCTP和Rheb之间的相互作用关系,并对TCTP的功能进行初步研究。 实验首先利用RT-PCR克隆绒山羊TCTP基因的cDNA,分析其表达特性;然后利用免疫共沉淀和Western-Blot鉴定免疫沉淀复合物中TCTP和Rheb的共同存在,证明二者的相互作用关系;接着构建TCTP基因和Rheb基因的酵母双杂交诱饵载体和靶载体,转化酵母菌,利用酵母双杂交技术进一步确定二者间的直接作用关系;最后构建TCTP过表达和RNA干扰载体,转染GFb细胞,利用Western-Blot检测总蛋白中mTOR信号通路效应分子mTOR、S6的表达量及磷酸化情况,确定TCTP是否参与了mTOR信号通路的调控,再利用流式细胞术检测细胞周期,明确TCTP是否具有调控细胞周期的功能。 绒山羊TCTP基因ORF全长519 bp,编码172个氨基酸残基,该基因在肝脏中表达量较高,在脑中表达量较低。免疫共沉淀检测到TCTP与Rheb具有相互作用。进一步的酵母双杂交鉴定表明二者具有直接的相互作用。TCTP过表达和转录后沉默TCTP基因显著影响mTOR和S6的表达,但对其磷酸化水平无影响。流式细胞术检测结果显示过表达TCTP对细胞周期没有影响,转录后沉默TCTP基因诱导细胞周期阻滞,表明TCTP可能与细胞周期进程相关。 本研究结果丰富了TCTP基因的遗传信息,证明绒山羊细胞中TCTP与Rheb之间具有相互作用关系,但可能不是Rheb的GEF,其参与mTOR信号通路活性和细胞周期进程调控的机制还有待于进一步研究。