论文部分内容阅读
目的：研究Toll样受体4(Toll-like receptor-4, TLR4)信号转导通路对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)增殖和氧化应激环境下凋亡的调控作用并探讨其潜在机制。方法：分别从C57BL/10J(wild-type)、C57BL/10ScNJ(TLR4lps-del)、C57BL/6J (wild-type)、MyD88-/-小鼠获取全骨髓细胞进行体外培养和传代,分离和纯化MSCs,研究其特性与TLR4的表达。以5-氮胞苷(5-Aza,10μmol/L)与MSCs共孵育,研究MSCs向心肌细胞的分化能力。以TLR4的配体—细菌脂多糖(LPS)激活TLR4信号通路,采用CCK-8(Cell Counting Kit)法检测MSCs增殖；以H2O2(100μmol/L)和无血清培养模拟氧化应激环境,采用流式细胞术和细胞核染色荧光显微镜检测MSCs的凋亡；取LPS刺激后的培养细胞上清液,采用ELISA法检测白细胞介素(IL)-6水平；以Western blot法检测LPS刺激MSCs后NF-κB (nuclear factor kappa B,核因子-κB)p65和Akt磷酸化水平的变化。给予不同浓度辛伐他汀预处理联合一定浓度LPS观察对MSCs增殖和凋亡的影响。结果：1,从全骨髓细胞中获取的、贴壁生长的成纤维样细胞具有MSCs的表型特征,经多次传代后仍保持其特性。在体外,MSCs经5-氮胞苷诱导后可表达心肌特异性蛋白；2,MSCs在mRNA和蛋白水平均表达功能性TLR4；3,低浓度LPS (0.1,1.0μg/ml)可显著促进MSCs增殖；4,H2O2和去血清培养可诱导MSCs凋亡；低浓度LPS可减少H2O2/去血清培养所致的MSCs凋亡。而高浓度LPS(10.0μg/ml)不能促进MSCs增殖,也不减少MSCs凋亡；5,在TLR4lps-del和MyD88-/-组,低浓度LPS对MSCs无保护作用；6,低浓度LPS(0.1,1.0μg/ml)可提高MSCs的NF-κB p65(Ser 536)磷酸化和Akt(Ser 473)磷酸化水平,但不能促进TLR4lps-del MSCs的NF-κB p65(Ser 536)和Akt (Ser473)磷酸化；7,低剂量辛伐他汀预处理联合适当剂量LPS可进一步促进MSCs增殖,但不能显著减少H202和去血清培养所致的MSCs凋亡。结论：1,通过对贴壁细胞的反复传代培养可从骨髓中分离和纯化MSCs; 2, MSCs具有分化为心肌细胞的潜能；3,骨髓MSCs表达功能性Toll样受体-4(TLR-4)；4,低浓度LPS可通过TLR4/MyD88信号途径促进MSCs增殖、减少氧化应激所导致的MSCs凋亡,而高浓度LPS不利于MSCs增殖和存活；4,TLR4对MSCs的保护机制与提高MSCs的NF-κB p65(Ser 536)和Akt (Ser 473)磷酸化水平有关；5,小剂量辛伐他汀联合适当浓度LPS有利于MSCs的存活。