利用分子标记鉴定山鸡椒性别的基础研究

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山鸡椒(Listea cubeba(Lour) Pers.),樟科(Lauraceae),木姜子属(Litsea lam.),广泛分布在我国南部山区,是重要的经济树种,为香精香料、医药及防腐剂等工业提供原材料。山鸡椒是雌雄异株植物,雌雄比例为10:1-10:2时可得到最大产量,但是目前缺乏准确鉴定雌雄的方法,造成实际生产中效率低下和资源浪费。本实验主要以分子生物学技术为主对山鸡椒性别鉴定展开研究,以期解决山鸡椒性别鉴定特别是早期幼苗鉴定的难题,主要得到以下结论:(1)构建了山鸡椒SRAP(Sequence-related amplified polymorphism)反应体系,20ul体系内,含有50ng/ulDNA模板2.8ul,10mM前后端引物各10ul,2.5mM dNTP2ul,缓冲液(含Mg2+)2ul,exTaq0.1ul,水10.5ul。优化了SRAP的PCR程序,最终选择37℃作为前五个循环的退火温度。对144对引物进行筛选,一共扩增出了1251条雄株条带,1256条雌株条带,只有17条雄株条带和22条雌株条带是特异的,最终选出了11条清晰的雌雄差异条带可以用于山鸡椒性别鉴定,分别来自11对引物组合。(2)为了将可重复性差的SRAP条带转化为稳定性好的SCAR(Sequence characterizedamplified regions)条带,根据11条SRAP条带序列设计28对SCAR引物,对山鸡椒雌雄基因组进行扩增,并在不同植株中进行验证,最终证明转化后的SCAR条带FD能够稳定的显示山鸡椒雌雄间差异。为了更进一步了解FD代表的信息,进行染色体步移,成功得到FD两侧翼序列,序列长度由700bp扩展到了3K左右。与此同时对于可能与性别相关的SRAP序列L,通过qRT-PCR的方法,最终发现在花蕾发育过程中,序列L表达量在雌雄间有明显的差异,雄株呈明显上升的趋势,而雌株表达量很少且几乎没有变化,推测序列L可能是性别发育相关基因,参与到花蕾发育的过程。(3)本实验分析发现山鸡椒DXS基因在雌雄间表达量有差异,并进一步分析,首次克隆出DXS基因全长,用Splign分析构建了DXS基因结构图,cDNA是2498bp,基因全长是6386bp,其中外显子10个,内含子9个,使用ExPASy在线计算工具预测分子量7.8×104,pI、是7.02。使用MEGA软件,采用邻位相连法,分析了山鸡椒DXS基因与其它物种的同源性。通过对来自10个地区共计29株单株山鸡椒进行直接测序法分析SNPs,一共检测到63个SNPs,有44个属于转换,17个属于颠换;在63个SNPs变异位点中,有53个变异位点导致同义突变,有10个变异位点导致错义突变,没有无义突变。
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