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目的:肝移植术是终末期肝病最有效的治疗手段,但其术后中枢神经损伤及认知功能障碍等神经系统并发症严重影响患者的预后及生存质量。肝缺血再灌注损伤(hepatic ischemia-reperfusion injury,HIRI)是肝移植术中极其重要且不可避免的病理生理过程,其主要病理机制包括炎症反应和氧化应激反应。细胞焦亡(pyroptosis)是一种炎性调控的程序性细胞坏死,其反应链中的模式识别受体(pattern recognization receptors,PRRs)可感受伤害性刺激而引发系列炎症反应引起组织损伤。外泌体(exosomes)是由各种细胞分泌的圆形或椭圆形的膜性囊泡,其内携带有多种功能成分(如脂质、蛋白质、m RNA、micro RNA、DNA等)且可通过血脑屏障(blood-brain barrier,BBB):外泌体作为细胞间信息传递的媒介,在多种神经炎症和神经退行性变疾病中发挥重要作用。本研究拟探讨外泌体在HIRI致海马和皮质损伤中的作用机制,为临床肝移植围术期脑损伤防治提供治疗靶点。方法:选用6周龄清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠(SD大鼠)建立70%肝脏热缺血再灌注损伤模型,分别于再灌注2h、6h、24h、3d和7d后取血清、海马及皮质组织,采用DCFH-DA荧光探针检测海马和皮质组织活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)含量,硫代巴比妥酸法检测组织丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,黄嘌呤氧化酶法检测组织超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性;采用免疫蛋白印迹法(western blot)检测海马和皮质组织细胞焦亡相关蛋白NOD-样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)、pro-caspase-1、cleaved-caspase-1、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)、gasdermin D(GSDMD)的表达情况;采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清中白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和IL-18的浓度;采用免疫组织化学染色法(immunohistochemical staining,IHC)检测海马和皮质组织中NLRP3的表达情况。采用超速离心法或外泌体提取试剂盒提取外泌体,采用western blot检测外泌体标记蛋白(CD63和CD9)的表达情况,同时采用透射电子显微镜观察外泌体的形态大小。利用PKH-26标记外泌体并经尾静脉注入大鼠体内,6h后取完整脑组织,采用荧光显微镜观察脑组织中外泌体的分布情况。选择再灌注6h建立大鼠动物模型,随机分为假手术组(S’组)、缺血再灌注组(IR’组)和外泌体处理组(EXO组),取血清、海马及皮质组织,检测指标同前。另取25只SD大鼠采用随机数字表法随机分为假手术组(S组)、缺血再灌注组(IR组)、缺血再灌注组+NLRP3炎性小体选择性抑制剂MCC950预处理10mg/kg、30mg/kg、50mg/kg(10M组、30M组和50M组),采用western blot检测海马和皮质组织NLRP3、pro-caspase-1、cleaved-caspase-1、GSDMD蛋白表达情况。最终选择50mg/kg作为MCC950预处理剂量,将30只SD大鼠随机分为生理盐水(NS)预处理+假手术组(N组)、MCC950预处理+假手术组(M组)、NS预处理+缺血再灌注组(N+IR组)、MCC950预处理+缺血再灌注组(M+IR组)、NS预处理+外泌体组(N+E组)、MCC950预处理+外泌体组(M+E组),各组检测指标同前。结果:实验结果分为以下四个部分:一、与对照组相比,所有HIRI处理组大鼠海马和皮质组织ROS和MDA水平升高,而SOD活性降低,且均于再灌注6h后升高最为显著(P<0.05),提示HIRI后大鼠脑组织氧化应激反应增强;海马和皮质组织NLRP3、cleaved-caspase-1/pro-caspase-1、ASC和GSDMD的表达水平,血清IL-1β和IL-18水平在HIRI处理组中明显升高(P<0.05),且于再灌注后6h升高最为显著,但pro-caspase-1表达水平在各时间点无明显差异,因此我们选择再灌注6h的大鼠模型作为进一步机制研究的动物模型;经光学显微镜观察亦发现大鼠海马和皮质组织于再灌注后6h出现NLRP3的表达明显升高。二、HIRI组大鼠血清外泌体CD63和CD9的表达水平较假手术组明显升高,并于再灌注后2h升高最为显著,因此HIRI可使血清外泌体含量明显增加;利用透射电子显微镜观察纯化的大鼠血清外泌体发现其为直径在30～100nm的圆形或卵圆形的低密度的膜性囊泡,符合外泌体的典型形态;利用荧光显微镜观察大鼠脑组织冰冻切片,可发现聚集于脑细胞核周围的被PKH26红色荧光标记的外泌体,提示外泌体具有透过血脑屏障的能力。三、与S’组比较,IR’组和EXO组大鼠海马和皮质组织ROS、MDA含量升高,SOD活性降低,NLRP3、cleaved-caspase-1/pro-caspase-1、ASC和GSDMD表达升高,血清IL-1β和IL-18水平升高(P<0.05);免疫组织化学染色后发现HIRI及其血清外泌体预处理均可使海马和皮质组织细胞浆内NLRP3表达增加。四、通过剂量预实验研究发现50mg/kg的MCC950预处理较10mg/kg和30mg/kg可明显降低HIRI组大鼠海马和皮质组织中NLRP3、cleaved-caspase-1/pro-caspase-1和GSDMD的表达水平(P<0.05),故选用50mg/kg作为MCC950的实验剂量并用于后期研究;MCC950预处理后可改善HIRI和外泌体处理所致的海马和皮质组织中NLRP3、cleaved-caspase-1/pro-caspase-1和GSDMD的表达及血清IL-1β和IL-18水平升高(P<0.05)。结论:HIRI可增加血清中HIRI相关外泌体的含量,经血液循环透过血脑屏障进入脑组织,激活海马和皮质组织中NLRP3炎性小体,导致细胞焦亡发生并具有时间依赖性引起脑损伤。通过阐述此机制,我们希望通过抑制外泌体释放和细胞焦亡而减少肝移植术后神经系统并发症。