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[背景与目的]在肿瘤的治疗中,将治疗性的基因导入肿瘤细胞或正常组织,逐渐成为肿瘤治疗研究的重要策略之一。然而,由于基因转导系统,转基因的表达对于肿瘤的靶向性及调节的局限性,使得实验室的观察结果难以应用于临床实践。最近有研究表明,肿瘤的基因治疗与其它种类的治疗方式结合后,可获得明显的基因治疗效果。早期生长反应基因Egr-1(early growth response gene-1)将肿瘤的基因治疗与放射治疗有机地结合起来,为肿瘤的基因治疗提供了一个新的应用前景。内皮抑素,最初由小鼠血管内皮瘤细胞系分离纯化得来的,由胶原ХVⅢC末端单基因片段编码的小约20-kDa肽段组成,位于血管的基因膜区域。在细胞水平上,内皮抑素特异性抑制内皮细胞的增殖和转移,并且诱导细胞凋亡。到目前为止,内皮抑素是当今在活体内,最有效的血管生成内皮细胞及肿瘤生长的特异性抑制剂之一。因此在本研究中,我们构建了pEgr-Endostatin-EGFP重组质粒,检测其辐射诱导特性,评价内皮抑素基因治疗结合局部X线照射治疗肿瘤的效果,目的在于,评价基因-放射联合治疗与单一的基因治疗或放射治疗相比,是否能显著地提高肿瘤的治疗效果[材料与方法] 1)材料:①pIRES2-EGFP质粒, pcDNA3.1-Egr质粒, pMD18T-Endostatin质粒;②小鼠B16黑色素瘤细胞;③C57BL/6成年雌性小鼠。2)方法:构建pEgr-Endostatin-EGFP重组质粒,通过限制酶切反应及PCR技术鉴定质粒是否构建成功;采用脂质体将pEgr-Endostatin-EGFP重组质粒转染导入小鼠B16黑色素瘤细胞,运用RT-PCR技术检测内皮抑素基因的表达,运用流式细胞术检测增强型绿色荧光蛋白的表达。荷瘤小鼠注射重组pEgr-Endostatin-EGFP质粒后,给予2 Gy X线照射,间隔48 h照射3次,肿瘤的生长在给予处理后18 d观察,肿瘤血管的生成则通过免疫组织化学在实验结束时进行检测。[结果]通过限制性内切酶反应与PCR技术证实,pEgr-Endostatin-EGFP重组质粒已构建成功,在小鼠B16黑色素瘤细胞转染该重组质粒并接受X线辐射之后,运用RT-PCR技术证实,在正常小鼠B16黑色素瘤细胞中没有特异性的内皮抑素条带,但在转染pEgr-Endostatin-EGFP重组质粒的各组中,无论黑色素瘤细胞是否给予X线辐射,均可检测到内皮抑素的阳性条带。转染pEgr-Endostatin-EGFP重组质粒的黑色素瘤细胞给予0.05~20 Gy的X线照射以后,均可观察到绿色荧光蛋白的表达。时程研究显示,转染pEgr-Endostatin-EGFP重组质粒的黑色素瘤细胞,在给予2 Gy X线照射8 h后,绿色荧光蛋白的表达达到峰值。将pEgr-Endostatin-EGFP重组质粒注射到C57BL/6J黑色素瘤荷瘤小鼠瘤体内,肿瘤的生长及肿瘤内微血管密度显著的受到了抑制。【结论】本研究成功构建pEgr-Endostatin-EGFP重组质粒,体外研究发现,Endostatin基因结合放射处理能够明显抑制B16黑素瘤细胞生长,其效果优于单纯照射组和单纯基因诱导组。活体研究发现,基因-放射联合治疗具有抗血管新生效应并明显抑制肿瘤生长。研究结果不仅对于改善化疗效果而且对于探索黑素瘤临床治疗新手段具有重要意义。