番茄斑萎病毒属病毒（Tospovirus）是最具危险性的植物病毒之一,每年在全球范围农艺作物上造成极为严重的经济损失,被列为十大最重要的植物病毒之一。番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus,TSWV）是番茄斑萎病毒属的典型种,由蓟马持久性循回增殖传播,能侵染90科900多种植物。番茄斑萎病毒属病毒目前已报道30多种,根据地理分布不同进一步分为美洲型和欧亚型。我国的番茄斑萎病毒属病毒种类在云南省鉴定较多,但在其他地区还有待更进一步的鉴定。植物基础防御反应包括模式触发的免疫（Pattern-triggered immunity,PTI）等,能够有效抵抗细菌、真菌、卵菌和病毒等病原物,但病毒如何诱导PTI等基础防卫还并不清楚。TSWV在番茄抗病蛋白Sw-5b作用下也可以诱导寄主的特异性抗性。Sw-5b是CNL类型免疫受体,能够识别TSWV的运动蛋白NSm从而介导特异抗性,但其中的抗性机制研究仍不充分。针对以上科学问题,本论文从以下三方面展开了研究:1.重庆地区tospovirus种类鉴定、全基因组测定和微型复制子反向遗传学体系构建本实验室在重庆地区采集到51个样品,其中鉴定出一株编号BS-2的发病莴苣感染了 tospovirus。通过RT-PCR结合测序手段从该样品上分离鉴定了马蹄莲褪绿斑点病毒（Callalily chloroticspot virus,CCSV）重庆分离物BS-2,并将其命名为CCSV-BS。对CCSV-BS进行了全基因组测序,发现其三条基因组RNAS、M及L分别包含3175、4713和8904个核苷酸。根据N蛋白核酸序列对CCSV分离物进行了系统发育分析,发现CCSV-BS与源自浙江的CCSV-Cel亲缘关系最近。我们还构建了 CCSV三条基因组RNA的微型复制子,为今后进一步研究该病毒提供了重要基础。2.Tospovirus编码的蛋白诱导植物基础防卫反应机制初探本研究以TSWV为模式,通过转录组测序分析,发现TSWV侵染的拟南芥大量基础防御相关基因如PR1上调,PR1在本氏烟中的同源基因PR-1A也能被TSWV诱导大量表达。为了找到诱导防御基因表达的TSWV蛋白,我们把PR-1A的启动子克隆到Luc报告基因上游,将TSWV编码的各蛋白与报告基因在本氏烟叶片中共表达。发现RdRp是PR-1A的诱导剂,而NSm则是抑制剂。为了找到植物识别RdRp的受体,通过VIGS手段沉默了 PTI中的共受体BAK1,发现RdRp依然能诱导沉默植株中PR-1A的表达。综上所述,TSWV侵染寄主会激活防御基因表达,而RdRp是这一过程的关键诱导剂。3.Tospovirus特异抗病蛋白Sw-5b结合DNA的体外初步研究Tospovirus特异性抗病蛋白Sw-5b是CNL类型免疫受体,需要定位在细胞核中来发挥抗性,但其在核内的靶标仍需进一步鉴定。此外,Sw-5b被NSm激活后大量基因转录水平发生了显著变化。先前报道某些进核发挥抗性的NLRs抗病蛋白具有结合基因组DNA的作用,本研究对Sw-5b结合DNA的特性进行了探究。在体外表达了Sw-5b的NB-ARC结构域和NB亚结构域,通过EMSA试验发现NB-ARC和NB都能在体外结合ssDNA探针,且NB-ARC与DNA亲和性比NB高许多,表明NB-ARC结构完整性对其结合DNA很重要。先前研究发现Sw-5b P-loop突变体K568R结合ADP能力下降且无法触发HR,我们发现NB-ARCK568R与ssDNA的亲和性与野生型相比并无明显差异,且无论NB还是NB-ARC都几乎不与dsDNA结合。综上所述,Sw-5b NB-ARC结构域可以在体外结合ssDNA。