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第一部分PQ及转录因子Nrf2对神经细胞miR-380-3p表达水平的影响目的应用qRT-PCR对小鼠神经母细胞系(Neuro-2a细胞)中miR-380-3p水平进行检测,确定百草枯(paraquat,PQ)暴露及转录因子Nrf2转录活性激活对神经细胞miR-380-3p表达水平的影响。方法(1)使用100μM、200μM浓度PQ对Neuro-2a细胞处理24 h、48 h后,提取RNA并进行逆转录与qPCR,测定miR-380-3p表达水平并比较PQ处理后其表达水平的变化(n=3)。(2)使用转录因子Nrf2特异激活剂特丁基对苯二酚(tBHQ)与PQ对Neuro-2a细胞进行处理,处理分组:tBHQ 40μM、tBHQ0μM;t BHQ 40μM+PQ 100μM、tBHQ 0μM+PQ 100μM。在通过qRT-PCR测定已知Nrf2下游基因NQO1的mRNA水平来验证转录因子Nrf2转录活性是否激活后,通过qRT-PCR测定miR-380-3p水平并比较Nrf2激活后miR-380-3p表达水平的变化(n=3)。(3)通过motif-based sequence analysis来寻找miR-380-3p上游启动子区域中可能存在的Nrf2结合位点。结果(1)100μM、200μM浓度PQ对Neuro-2a细胞处理24 h、48 h后,对细胞中miR-380-3p表达水平进行检测,与对照组相比miR-380-3p表达水平均下降(P<0.05),但两个剂量组间miR-380-3p表达水平差异无统计学意义。在PQ处理48 h后,与对照组比较,Neuro-2a细胞中的miR-380-3p依然表现为下调(P<0.05),且高剂量组200μM处理的Neuro-2a细胞中miR-380-3p的表达水平要低于低剂量组100μM(P<0.05),且处理时间和使用剂量之间存在交互作用(P<0.01)。(2)40μM浓度的tBHQ对Neuro-2a细胞处理48 h后,检测细胞内NQO1 mRNA表达水平,NQO1 mRNA水平发生上调(P<0.0001),说明Nrf2转录活性被激活;同时miR-380-3p的表达水平,与未使用tBHQ处理的对照组细胞相比,也发生上调(P<0.001)。在PQ存在(100μM)的情况下,40μM tBHQ处理48 h仍然能够激活Nrf2转录活性,即上调NQO1 mRNA表达水平(P<0.001);且miR-380-3p表达水平也随着Nrf2转录活性的激活发生上调(P<0.0001)。(3)miR-380-3p所在的microRNA簇上游启动子区域中存在Nrf2潜在结合位点(P<0.0001)。结论100μM、200μM浓度的PQ处理可下调神经细胞内miR-380-3p表达水平;转录因子Nrf2的激活可以上调神经细胞内miR-380-3p表达水平,Nrf2可能参与miR-380-3p的转录。第二部分miR-380-3p在PQ致神经细胞损害中的作用目的通过使用miR-380-3p的模拟物及抑制剂,特异性地改变Neuro-2a细胞内miR-380-3p的丰度,达到miR-380-3p功能上调和抑制,观察miR-380-3p在PQ致神经细胞损害过程中对细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期改变中的影响。方法(1)使用不同浓度PQ(50μM、100μM、200μM)对Neuro-2a细胞进行处理之前,对细胞瞬时转染miR-380-3p mimic/mimic NC、inhibitor/inhibitor NC(NC,negative control),并在PQ处理48 h后对细胞增殖活力进行测定(n=6)。(2)对Neuro-2a细胞瞬时转染miR-380-3p mimic/mimic NC、inhibitor/inhibitor NC,并使用PQ(0μM、100μM)处理48 h后使用PI染色法对细胞周期分布进行测定(n=3)。(3)对Neuro-2a细胞瞬时转染miR-380-3p mimic/mimic NC、inhibitor/inhibitor NC,并使用PQ(0μM、100μM)处理48 h后使用Annexin v-fitc/PI双染色法对细胞凋亡情况进行测定(n=3)。结果(1)转染miR-380-3p mimic后,细胞增殖活性受到抑制:在0μM、50μM、100μM浓度PQ处理组中,转染miR-380-3p mimic的细胞与转染对应NC序列的细胞相比细胞增殖活力均有下降(P<0.05),而各NC组与未转染组间细胞增殖活性差异无统计学意义(P>0.05)。双因素方差分析发现转染序列、PQ处理浓度之间存在交互作用(P<0.01)。而在使用miR-380-3p inhibitor对细胞进行转染时,经过0μM、50μM、100μM、200μM浓度PQ处理48 h后,与miR-380-3p inhibitor NC组相比,细胞增殖活力差异无统计学意义(P>0.05)。(2)在无PQ存在的情况下,转染miR-380-3p mimic(miR-380-3p上调)使Neuro-2a细胞处于G2/M期比例与mimic NC组相比下降(P<0.001),而S期细胞比例上升(P<0.01);inhibitor组细胞G0/G1期比例、S期比例与inhibitor NC组相比差异均无统计学意义(P>0.05),各NC组与未转染组相比细胞G0/G1期、S期、G2/M期比例差异无统计学意义(P>0.05)。在100μM浓度PQ处理48 h后,mimic组与mimic NC组相比G0/G1期细胞比例上调(P<0.001),且G2/M期细胞比例发生下调(P<0.001);而inhibitor组与inhibitor NC组相比,各期细胞比例差异无统计学意义(P>0.05)。(3)细胞在仅进行miR-380-3p mimic/mimic NC、miR-380-3p inhibitor/inhibitor NC瞬时转染48 h后,miR-380-3p mimic组细胞凋亡率与mimic NC组相比升高(P<0.001),而miR-380-3p inhibitor组细胞与inhibitor NC组相比,凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。此外,在对细胞瞬时转染miR-380-3p mimic/mimic NC、inhibitor/inhibitor NC后,使用PQ(100μM)处理48 h后,miR-380-3p mimic组细胞凋亡率与mimic NC组相比升高(P<0.0001),而miR-380-3p inhibitor组细胞与inhibitor NC组相比,凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。结论miR-380-3p的过表达可导致神经细胞(Neuro-2a)增殖活性下降、凋亡率升高以及周期阻滞,而对miR-380-3p的抑制对神经细胞增殖活性、凋亡率及周期分布没有明显影响。第三部分miR-380-3p对Sp3表达的调控作用及机制目的 使用miR-380-3p mimic/mimic NC、inhibitor/inhibitor NC对Neuro-2a细胞进行瞬时转染后,测定Sp3 mRNA水平及蛋白质水平,确定miR-380-3p对Sp3表达的调控作用。并通过双荧光素酶报告基因实验来确定miR-380-3p在Sp3mRNA 3’UTR区域的结合位点。方法(1)在对Neuro-2a细胞瞬时转染miR-380-3p mimic/mimic NC、inhibitor/inhibitor NC后的24 h和48 h,对细胞内的Sp3 mRNA水平使用qRT-PCR进行检测(n=3)。(2)对Neuro-2a细胞瞬时转染miR-380-3p mimic/mimic NC、inhibitor/inhibitor NC 48 h后,提取细胞总蛋白并通过Western-blot对细胞内Sp3蛋白质水平进行测定(n=3)。(3)将预测的miR-380-3p结合位点的野生型/突变型序列插入psiCHECKTM-2 Vector双荧光素酶报告基因表达载体中海肾荧光素酶基因下游,并将其与miR-380-3p mimic或mimic NC共转染入人肾上皮细胞系293T中,24 h后将细胞裂解并进行荧光素酶检测(n=3)。结果(1)转染miR-380-3p mimic/mimic NC、inhibitor/inhibitor NC 24 h、48 h后,细胞内的Sp3 mRNA水平在各组间的差异无统计学意义(P>0.05)。(2)对Neuro-2a细胞瞬时转染miR-380-3p mimic/mimic NC、inhibitor/inhibitor NC 48h后,与相应NC组相比,转染miR-380-3p mimic的细胞Sp3蛋白水平下降(P<0.05);而转染miR-380-3p inhibitor的细胞内Sp3蛋白水平与其NC对照组相比升高(P<0.05)。(3)将含野生型mi R-380-3p结合位点的双荧光素酶报告基因表达载体与miR-380-3p mimic共转染后,与共转染mi R-380-3p mimic NC的细胞组相比,海肾荧光素酶的表达水平降低(P<0.0001);而在将预测位点序列进行突变后,共转染mi R-380-3p mimic的细胞中海肾荧光素酶的表达水平与共转染miR-380-3p mimic NC组差异无统计学意义(P>0.05)。结论miR-380-3p通过与Sp3 mRNA 3’UTR区域结合抑制其翻译从而下调其蛋白质表达水平,而不会导致其mRNA降解;且miR-380-3p与Sp3 mRNA 3’UTR区域结合位点与预测结果相符。