氨基糖苷类抗生素钝化酶的产生是细菌对该类抗生素耐药的主要机制，16S rRNA甲基化酶是近年出现的一种介导革兰氏阴性菌对氨基糖苷类抗生素高水平耐药的酶，而位于质粒和转座子上的整合子能够捕获一个或多个耐药基因，造成细菌的多重耐药性和耐药基因的传播和扩散。传统的检测方法虽便于兽医临床推广使用，但耗时长、操作繁琐；现有的一些分子生物学检测手段也无法满足耐药性监测所需的快速、高通量的目的。本研究拟调查氨基糖苷类抗生素钝化酶基因、16S rRNA甲基化酶基因及整合酶基因在广东省各地区兽医临床细菌中的流行情况，并尝试将生物传感器技术与传统基因芯片技术相结合构建生物传感器芯片对耐药基因进行检测。 1.大肠杆菌氨基糖苷类耐药酶及整合子流行病学调查 自2002至2005年内收集的515份大肠杆菌样本均分离自广东省各地区的规模化养殖场，采用微量肉汤二倍稀释法对515株畜禽大肠杆菌进行6种氨基糖苷类抗生素敏感性分析；通过PCR扩增、序列分析检测氨基糖苷类钝化酶基因、16S rRNA甲基化酶基因及整合酶基因，并用建立的PCR方法调查各基因在515株畜禽大肠杆菌中的流行分布情况。药物敏感性分析结果表明，515株大肠杆菌对6种抗生素的耐药率从高到低依次为链霉素53.98％、卡那霉素40.78％、庆大霉素33.01％、大观霉素31.65％、新霉素29.32％、阿米卡星8.93％，各药耐药率随着时间推移有逐渐增高的趋势；515株大肠杆菌中对6种氨基糖苷类都敏感的菌株占30.29％，1耐、2耐、3耐、4耐、5耐、6耐株分别为19.42％、13.40％、13.59％、10.49％、8.16％、4.66％.共有38种多重耐药谱型。耐药基因流行分布调查结果显示，515株大肠杆菌中未检测到aac(3)-Ia、aph(2)-Ib基因，其余10种氨基糖苷类钝化酶基因检出率从高到低依次是aac(3)-Ⅶ(97.28％)、aac(3)-Ⅱ(94.17％)、aadA2(71.07％)、aadA1(58.84％)、aac(3)-Ⅱc(39.61％)、aac(3)-Ⅳ(37.28％)、aph(4)-Ia(31.84％)、aph(3)-Ⅳ(16.70％)、aac(6)-Ib(15.34％)、aadB(2.52％)；515株大肠杆菌中有27株检测到16S rRNA甲基化酶rmtB基因，检出率为5.24％；整合酶intl1、intl2基因的检出率分别为75.92％、3.69％。氨基糖苷类耐药酶基因谱型错综复杂，13种耐药基因共有127种组合方式，以aadA1+aadA2+aph(3)-Ⅱ+aph(3)-Ⅶ四种基因的联合方式最为常见。515株大肠杆菌耐药表型和钝化酶基因谱型关系复杂，总体趋势上一致，但未能完全对应。 2.大肠杆菌aac(6)-Ib-cr基因的初步研究 通过PCR扩增、序列测定及与Genebank中登录序列进行比对分析，确定aac(6)-Ib-cr基因的检出率，并筛选aac(6)-Ib-cr、qnrA双基因阳性菌，采用膜接合试验初步研究两基因的共同作用机制。结果发现，515株大肠杆菌中检出33株aac(6)-Ib-cr阳性株，检出率6.41％，检测到aac(6)-Ib-cr、qnrA双基因阳性菌1株，接合子中仅检测到aac(6)-Ib-cr基因，未扩增到qnrA目的片段。说明aac(6)-Ib-cr基因在广东省兽医临床尚未广泛流行，aac(6)-Ib-cr与qnrA有可能存在于不同的质粒上。 3.氨基糖苷类药物耐药性检测生物传感器芯片的研制 针对aac(3)-IIc、aac(6)-Ib、aadA1、aadA2、aph(4)-Ia、rmtB、intl1、intl2 8种基因设计捕获探针，均为寡核苷酸探针，构建耐药性检测生物传感器芯片。通过生物素化的引物PCR扩增制备8种标记探针，与芯片在一定温度下杂交。利用多重PCR法制备标记探针与芯片杂交。杂交结果表明，芯片杂交信号明显，肉眼清晰可见，无需借助仪器观察：60℃是芯片杂交的最佳温度；8种探针特异性好，无交叉反应，对检测的耐药基因具有有效性；芯片的灵敏度为3pg/μL DNA模板浓度；芯片重复性好、稳定性高，能检测多种基因的混合样品；确定了3组多重PCR体系，通用退火温度为51℃，能对8种基因进行有效扩增，制备的标记探针能与芯片发生有效杂交。检测结果无需配备专门的仪器设备直接可用肉眼进行判断，适于兽医临床推广应用。