日本脑炎(Japanese encephalitis, JE),又称流行性乙型脑炎(Epidemic Encephalitis B),是由日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus, JEV)引起的以中枢神经系统损害为主的急性传染病。该病对猪的致死率不高,但可引起怀孕母猪流产、死胎或木乃伊胎,公猪发生睾丸炎而不育。JEV在鸟与蚊子之间有一个区域性传播循环,猪作为中间扩增宿主,带毒蚊子通过叮咬将感染性病毒传播给人。这不仅严重危害养猪业的健康稳定发展,而且还严重威胁着人类的公共卫生安全。尽管目前对JEV的病原学、分子生物学和免疫学特性的研究已取得了很大的进展,疫苗的应用也使乙脑的发病率有所下降,然而幸存者也往往会留有严重的后遗症,尚无有效的抗病毒治疗药物,而且JEV的致病的分子机制仍不完全清楚,因此,JEV的致病机理和抗病毒研究成为当前研究的重点和难点。病毒与细胞表面相应受体的结合是病毒生命周期中的始动环节,也是影响病毒宿主范围、组织嗜性和致病性的决定因素之一。病毒入胞于是也成为当前抗病毒治疗和抗病毒药物设计一个具有吸引力的靶点。一般认为JEV囊膜糖蛋白E是该病毒的病毒吸附蛋白(virus attachment protein, VAP),介导JEV与宿主细胞受体结合及膜融合。研究发现黄病毒的E蛋白含有3个结构域,即结构域Ⅰ、结构域Ⅱ和结构域Ⅲ。其中,结构域Ⅲ(domainⅢ, DⅢ)被认为是受体的主要结合部位,而且该结构域中保守基序(Arg387-Gly387-Asp389, RGD)的单氨基酸突变可能影响JEV的受体识别和毒力。本研究从病毒黏附蛋白和细胞受体的两个角度探讨了日本脑炎病毒入胞机制并以此为靶点对其靶向抑制分子进行了筛选和抗病毒活性评价。研究内容具体如下：1.日本脑炎病毒E蛋白受体结合域及其突变体的可溶性表达与多克隆抗体制备本试验利用点突变技术和基因重组技术构建了日本脑炎病毒囊膜蛋白结构域Ⅲ(EDⅢ)及其保守的RGD基序单氨基酸突变体(△EDⅢ, RGD突变为RGE)的原核表达载体,通过低温诱导(18℃)的策略获得了其可溶性重组蛋白。并以纯化EDⅢ蛋白免疫小鼠获得了抗EDⅢ的多克隆抗体。Western blot结果表明可溶性EDⅢ和ΔEDⅢ能被猪源JEV阳性血清所识别,制备的血清具有很好的特异性,为后续的研究奠定了基础。2.囊膜蛋白结构域Ⅲ及其保守的RGD基序在日本脑炎病毒入胞过程的作用分析本研究比较了含有保守RGD基序的重组E DⅢ蛋白或RGD多肽及其单氨基酸突变体(RGD突变为RGE)的重组ΔEDⅢ蛋白或RGE多肽结合到BHK-21细胞膜受体的能力。细胞黏附试验和流式细胞术结果显示重组E DⅢ蛋白较之其突变体能更有效地结合到BHK-21细胞膜表面,而且重组E DⅢ蛋白和RGD多肽与BHK-21细胞预孵育后能显著地抑制JEV感染BHK-21细胞,其抑制率分别达到65%和98%,然而RGD基序的突变(RGD突变为RGE)使得其抑制率分别下降到22%和52%。由此可推测,JEV是通过其囊膜蛋白上保守的RGD基序与靶细胞的膜受体相结合来介导其入胞的。这也进一步证实了,JEV囊膜蛋白DⅢ是其细胞膜受体的结合域,且可作为JEV入胞抑制剂的候选分子。3.日本脑炎病毒囊膜蛋白特异性结合肽的筛选与鉴定本试验以纯化的重组囊膜蛋白(Trx-E)作为靶标,Trx作为对照,对噬菌体随机12肽库进行4轮亲和筛选,挑取单克隆ELISA初步鉴定噬菌体克隆特异性,阳性克隆测序后合成多肽,应用表面等离子共振技术(SPR)进一步鉴定多肽的亲和力。ELISA结果显示,在随机挑选的20个单克隆当中,15个克隆靶向结合到重组蛋白Trx-E的囊膜蛋白(E)区域,5个克隆靶向结合到重组蛋白Trx-E的硫氧还原蛋白(Trx)区域。SPR试验进一步证实,5个人工合成多肽在一定程度上均能特异性结合到Trx-E的囊膜蛋白(E)区域,其中,多肽P1与Trx-E的囊膜蛋白(E)区域亲和力最高,其氨基酸序列为：TPDCTRWWCPLT。这为进一步研究JEV的入胞机制和靶向抗病毒治疗奠定了基础。4.日本脑炎病毒囊膜蛋白结合肽体内外抗病毒活性的研究本研究在前一章筛选到5个日本脑炎病毒囊膜蛋白结合肽的基础上,进一步评价了其抑制JEV感染的活性。Q-PCR结果显示5个囊膜蛋白结合肽在一定程度上均能抑制JEV感染BHK-21细胞,其中P1的抑制率最高,达到85%以上。进一步的PRNT结果证实P1在BHK-21、PK15和Vero细胞均呈现剂量依赖的抑制JEV感染的活性。而且,小鼠腹膜内接种试验表明P1预孵育JEV较之对照组能有效地减少(轻)病毒血症和致死率以及中枢神经系统的组织病理损伤。这些结果为JEV的抗病毒治疗和药物设计提供了一个新的思路。5.日本脑炎病毒在PK15细胞上膜受体的鉴定目前,JEV在猪源细胞上受体分子仍不清楚。本研究选择PK15细胞为主要的研究对象,同时选用Vero和BHK-21细胞,应用VOPBA鉴定出多个与JEV结合的蛋白,其中一个共有的约74kDa的JEV结合蛋白被随后的Western blot试验证实为HSC70。抗HSC70抗体能阻断JEV与上述三种细胞的结合,间接免疫荧光试验和激光共聚焦显微镜观察显示HSC70定位在BHK-21、PK15和Vero细胞膜上,提示HSC70可能是BHK-21、PK15和Vero细胞上的一个共有JEV受体候选分子。在BHK-21和Vero细胞上约67kDa、80kDa和105kDaJEV结合蛋白在JEV入胞过程起什么作用,是否是辅助受体,尚待进一步研究。综上所述,这些研究结果将为深入乙脑致病机制的解析及其新型抗病毒药物的设计提供了新的思路和有益的线索。