【目的】慢性痛可分为癌性痛和非癌性痛,多由组织损伤、炎症、神经损伤或癌症浸润到周围组织神经侵蚀所致,具有复杂的临床表现特征如:持续性自发痛、原发性或继发性痛敏、镜像痛或痛敏等。最近大量的研究结果显示疼痛的发生和持续慢性化机制是由多条信号转导通路所介导的复杂的过程,而且涉及外周损伤部位和中枢多层次上的细胞和分子病理生理过程,也是外周伤害性感受器和中枢神经元双重敏化的结果。提示在神经系统不同部位进行多个分子靶点阻断才能获得长期有效的慢性痛治疗效果,因此分子多靶点镇痛策略在镇痛新药筛选和研发中具有重要的理论和实际意义。建立适当的筛选方法是发现新药和新适应症,以及筛选出具有知识产权的先导化合物、避免生物活性资料丢失的关键。以往镇痛药的筛选与研究多为单一药效或单一药代动力学参数的观察,缺少药效-药代时效结合模型研究。另外,还由于镇痛药的镇痛效果、时程和选择性可能因疼痛的刺激模式(pain stimulus modality,如机械刺激、热刺激或化学刺激等)或疼痛的状态(pain state,如生理与病理状态,或炎性痛与神经损伤性痛等)不同而不同,因此开展多参数药效-药代动力学( multiple pharmacodynamics - pharmacokinetics, mPD-PK)研究对筛选新药或老药新用等都具有重要的理论和实际意义。为了建立一个能够适当评价镇痛药的效果、时程和选择性的mPD-PK结合模型,本研究对疼痛的刺激模式(如机械刺激和热刺激)与疼痛的状态(如生理与病理状态,炎性痛与神经损伤性痛)对吗啡(morphine, Mor)的PD-PK时效特征的影响以及可能的新特征进行了系统而深入的研究。以下是本学位论文的主要实验方法、结果和结论。【方法】针对疼痛的刺激模式,我们在以上三种状态或模型下检测吗啡对机械刺激或热刺激引起的痛反应或痛敏作用的PD-PK时效特征进行比较研究。针对疼痛的状态,我们采用:(1)未经任何处理的大鼠(作为生理状态);(2)一侧外周皮下致炎痛模型;(3)一侧外周神经损伤模型,比较吗啡在不同痛状态和痛模型下的PD-PK时效特征。此外,为了排除给药途径因素的作用,我们还同时比较观察了灌胃(i.g.)和腹腔(i.p.)注射两种给药途径对以上疼痛状态和疼痛刺激模式下的PD-PK时效特征的影响效果。具体痛或痛敏的定量检测方法如下:(1)用辐射热刺激测量大鼠后足底热刺激缩足反射潜伏期(paw withdrawal thermal latency,PWTL)。(2)用一组von Frey纤维测量大鼠后足底机械刺激缩足反射阈值(Paw withdrawal mechanical threshold PWMT)。炎性痛和神经损伤性痛动物模型的选择和制作:(1)蜜蜂毒试验模型,将0.2 mg/50μl蜜蜂毒注入大鼠一侧后足皮下,制备外周炎性痛模型。(2)选择保留外周神经损伤模型(spared nerve injury model,SNI),在麻醉动物将其一侧后肢踝部胫神经和腓总神经切断,而保留腓肠神经,制备外周神经损伤模型。PD-PK时效特征研究的具体方法如下:(1)在吗啡给药15,30,45,60,90,120,180,240,300和360分钟之后,采血和脑脊液(cerebral spinal fluid,CSF),然后应用HPLC结合β-D-葡萄糖醛酸水解法测定血样或CSF中游离吗啡浓度和结合吗啡浓度(即吗啡在体内的主要中间代谢物,用药物总浓度-游离药物浓度取得数值)。(2)通过药代动力学计算程序-3P87/3P97或采用新药统计学软件-NDST中药代动力学计算程序求出有关药动学参数,参比美国Pharsight公司WINNONLIN程序。统计学处理采用SPSS 11.5有关程序。【结果】第一部分:吗啡抗机械痛反应和抗热痛反应的多参数药效-药代动力学特征:生理状态下研究1.Mor对正常大鼠的抗热痛反应和抗机械痛反应的镇痛时-效作用不同(1)两种给药途径(i.g. or i.p.)的Mor均可以提高正常大鼠热和机械性刺激痛阈值,但是作用时程有显著差异。即单剂量Mor的抗热痛反应镇痛时程与抗机械痛反应镇痛时程相比较显著缩短,其对前者的最高镇痛效应仅仅维持5-15 min,而后者却持续约4h。(2)Mor抗机械痛反应镇痛效应的达峰时间(Tmax)比抗热痛反应镇痛效应的Tmax滞后约5 min ( i.g.)或15 min ( i.p.)。(3)Mor抗机械痛反应镇痛效应的最大药效(Emax,% MPE )比抗热痛反应的Emax ( % MPE )约高40% ( i.g.)或20% (i.p.)。(4)药效-时程曲线下面积(areas under the effect-time curve,AUE): Mor抗机械痛反应镇痛效应的AUE比抗热痛反应镇痛效应的AUE大1-2倍,而且两种给药途径(i.g. or i.p.)无显著差异。2.Mor镇痛作用药代动力学的特征(1)采用药代动力学计算程序自动拟合求出Mor及其代谢产物对应的房室模型,结果提示游离Mor的分布和代谢为一室模型,而结合Mor的分布和代谢为二室模型,而且两种给药途径(i.g. or i.p.)的室性无显著差异。(2)浓度-时程曲线下面积(areas under the concentration-time curve,AUC):AUC评估比较显示,i.g.给药途径血液结合吗啡的AUC约为游离吗啡AUC的4.4倍,而i.p.给药途径血液结合吗啡AUC约为游离吗啡AUC的5.6倍。(3)结合Mor浓度的达峰时间(Tmax)比游离Mor浓度的Tmax分别延迟约15 min (i.g.)和30 min (i.p.)。3.Mor的mPD-PK结合模型:浓度-效应-时程环特征为了找出Mor的mPD-PK结合模型特征,我们采用浓度(C)-效应(E)-时程(T)环(hysteresis loop)模型来观察吗啡抗热痛反应和抗机械痛反应镇痛的CET特征。结果发现该模型可以准确地反映Mor对正常大鼠的抗热痛反应和抗机械痛反应镇痛时效不同的特征和原因:(1)吗啡抗热痛反应镇痛的CET符合顺时针模式(clockwise PK-PD model),即吗啡给药后血液游离吗啡和结合吗啡浓度的达峰时间快,且与药效达峰时间一致或晚于后者,呈短时程速效模式;(2)吗啡抗机械痛反应镇痛的CET符合逆时针模式(counter clockwise PK-PD model),即吗啡给药后血液游离吗啡和结合吗啡浓度的达峰时间慢而显著延迟,但高药效持久且不随血药浓度减低而减低,呈滞缓慢效模式。该部分结果提示疼痛的刺激模式(热刺激与机械刺激)不同,吗啡的镇痛作用浓度-时-效特征(即CET环)也不同,而且吗啡对正常大鼠的抗热痛反应和抗机械痛反应镇痛时效作用的不同可能与该药的CET环特征模式不同具有相关性,短时程速效模式(clockwise PK-PD model)反映了吗啡抗热痛反应镇痛的时效与血药浓度达峰和持续时间高度相关,而滞缓慢效模式(counter clockwise PK-PD model)反映了吗啡抗机械痛反应镇痛的时效与血药浓度达峰和持续时间无密切关系,因此我们推测吗啡抗热痛反应镇痛作用部位可能主要在外周,而吗啡抗机械痛反应镇痛作用部位可能主要在中枢。第二部分:吗啡抗机械痛敏和抗热痛敏的多参数药效-药代动力学特征:生理与病理状态的比较研究1.生理和病理状态Mor抗热痛反应和抗机械痛反应镇痛时-效的比较为了探讨疼痛的状态是否对吗啡mPD特征有影响,本部分分别比较研究了生理与病理状态和炎性痛与神经损伤性痛状态的mPD时程特点,本部分研究以灌胃给药途径为主。(1)从吗啡抗热痛反应时-效曲线的结果来看,外周炎症时药效达峰时间为给药后22.50±5.61(n=6)分钟,而正常动物的药效达峰时间为给药后40.00±3.46(n=6)分钟,提示外周炎性痛状态可以显著缩短药效的达峰时间,即缩短了约20分钟。(2)从吗啡抗机械痛反应时-效曲线的结果来看,外周炎症时药效达峰时间为给药后45分钟,外周神经损伤性痛时药效达峰时间为给药后90分钟,而正常动物的药效达峰时间为给药后30分钟,提示外周炎性和外周神经损伤性痛两种状态均可以显著滞缓药效的达峰时间,即延长了15-60分钟。值得注意的是口服吗啡在外周神经损伤性痛状态时起效和达峰时间均显著滞缓,AUE显著减小(vs.正常,或炎症状态,P<0.01),这一结果从mPD的时间特征上解释了为什么吗啡在临床治疗神经损伤性痛时疗效差的原因。2.生理和病理状态Mor镇痛作用药代动力学特征的比较为了进一步了解疼痛的状态对PK特征的影响作用,本部分比较了正常、外周炎性和外周神经损伤性痛状态时吗啡的浓度-时程曲线和浓度-效应曲线,结果观察到:(1)外周神经损伤性痛状态时结合吗啡的AUC均较正常和外周炎症时显著减小(P<0.01)。(2)比较游离吗啡血药浓度达峰时间,发现正常时为45分钟,外周炎症时为35分钟,外周神经损伤时为30分钟,且最后者的值与前两者比较具有显著意义;而不同的是,比较血液结合吗啡的血药浓度达峰时间,发现正常时为60分钟,外周炎症时为45分钟,外周神经损伤时为60分钟,提示炎症时血液结合吗啡的血药浓度达峰时间要快于正常和外周神经损伤时。(3)三种痛状态时游离和结合吗啡血药浓度的Cmax无显著差异。(4)浓度-效应曲线显示,与生理状态的吗啡抗热痛反应的浓度-效应曲线相比较,外周炎性痛时的游离和结合吗啡的曲线均左移;相反的是,与生理状态的吗啡抗机械痛反应的浓度-效应曲线相比较,外周炎性和外周神经损伤性痛时的游离和结合吗啡的曲线均右移。(5)EC50值结果显示:在评价吗啡抗热痛反应的浓度-效应时,炎症时的EC50值显著小于正常时的EC50值,提示外周炎症时吗啡-受体亲和力显著增强(或内在活性也增强);相反的是,在评价吗啡抗机械痛反应的浓度-效应时,外周炎症和神经损伤时的EC50值均显著大于正常时的EC50值(神经损伤>炎症>正常),提示刺激模式和痛状态不同吗啡-受体的亲和力和内在活性可能发生改变,由此导致吗啡的浓度-效应特性改变。3.生理和病理状态Mor的mPD-PK结合模型:浓度-效应-时程环特征的比较为了观察疼痛的状态是否影响Mor的mPD-PK结合模型特征,本部分结果比较了上述三种痛状态和模型下CET环的特征,结果显示无论是在评价吗啡抗热痛反应的CET,还是在评价吗啡抗机械痛反应的CET,外周炎症和神经损伤时均不影响其各自的CET特征。即吗啡抗热痛反应的CET还是符合短时程速效模式(clockwise PK-PD model),而吗啡抗机械痛反应的CET也符合滞缓慢效模式(counter clockwise PK-PD model)。该部分的结果提示不仅上述疼痛的刺激模式可以影响吗啡的PD-PK模式特征,疼痛的状态也影响吗啡的PD-PK模式特征。但不同的是,疼痛的状态不影响吗啡对不同刺激模式引起痛反应的CET模式,但却显著影响吗啡在血液中的吸收等相关药动学参数和游离吗啡-受体、结合吗啡-受体的亲和力或内在活性。外周炎症和神经损伤均可能加快游离吗啡的吸收时间,但是只有外周炎症才可以加快血液吗啡的代谢过程。在不同刺激模式和痛状态下,吗啡-受体的亲和力或内在活性发生显著改变。第三部分:吗啡抗热痛敏与抗机械痛敏的作用部位:多参数药效-药代动力学模型根据本研究的第一部分结果,我们推测吗啡抗热痛反应镇痛作用部位可能在外周存在,而抗机械痛反应镇痛作用部位可能主要在中枢。为了进一步研究吗啡抗热痛敏与抗机械痛敏的作用部位,我们比较研究了血液和脑脊液中游离吗啡和结合吗啡的mPD-PK特征,这部分数据以外周炎症时灌胃给药的数据为主要分析对象。1.脑脊液与血液样本游离和结合Mor镇痛作用药代动力学特征的比较与血液样本相比,脑脊液样本中游离和结合吗啡的分布和代谢均为二室模型,结合吗啡的AUC比游离吗啡的AUC大2.5倍(结合vs.游离:103813.18±190.92 vs. 42082.67±344.24 min·μg/L),脑脊液游离吗啡浓度达峰时间Tmax比结合吗啡快10分钟(50.00±3.46 vs. 60.00 min),且均比血液浓度达峰时间慢15分钟(可能由于血脑屏障缘故)。通过观察比较浓度-效应曲线和相关EC50值,结果显示无论是血液样本还是脑脊液样本,在评价抗热痛敏镇痛效应时,游离吗啡的EC50值都小于结合吗啡的EC50值;在评价抗机械痛敏时,虽然血液样本中游离吗啡EC50值小于结合吗啡的EC50值,但不同的是,脑脊液中结合吗啡EC50值小于游离吗啡的EC50值,提示疼痛刺激模式对脑脊液浓度-效应曲线和配体-受体亲和力也有一定影响。2.脑脊液与血液样本游离和结合Mor的mPD-PK结合模型:浓度-效应-时程环特征的比较为了进一步分析吗啡抗热痛敏与抗机械痛敏的作用部位,我们比较分析了脑脊液与血液样本中游离吗啡和结合吗啡mPD-PK结合模型特征,即CET环的特征。结果显示在评价吗啡抗热痛反应的CET时,与血液样本相似,也表现为短时程速效模式(clockwise PK-PD model),但脑脊液游离和结合吗啡CET环显示浓度达峰时间较药效达峰时间显著延迟,且在60-120分钟浓度达峰持续稳定时镇痛作用却递减,提示有吗啡耐受现象。在评价吗啡抗机械痛反应的CET时,滞缓慢效模式(counter clockwise PK-PD model)也相似,但值得注意的是,脑脊液中结合吗啡在达峰后,即在45-300分钟期间浓度持续维持在高浓度(300-450μg/L)水平,与持续高药效相一致。而游离吗啡则与血液样本的特征一致。此外,通过高斯相关回归分析,结果显示吗啡抗热痛反应的镇痛作用与血液游离和结合吗啡的浓度-时间因素高度相关(r值分别为0.9981和0.9909),但虽然与脑脊液的游离吗啡浓度-时间因素相关(r值为0.6218),却与脑脊液的结合吗啡浓度-时间因素无关(r值为0.4948),提示吗啡抗热痛反应的镇痛作用主要取决于血液中的游离和结合吗啡的作用。与上述结果相对应,吗啡抗机械痛反应的镇痛作用与脑脊液游离和结合吗啡的浓度-时间因素高度相关(r值分别为0.7509和0.9992),而与血液中游离吗啡有一定相关性(r值为0.5473),但与血液的结合吗啡无相关性(r值为0.4463),提示吗啡抗机械痛反应的镇痛作用主要取决于脑脊液(跨血脑屏障进入脑脊髓组织)中结合和游离吗啡的作用。【结论】:(1)疼痛刺激模式(热刺激与机械刺激)可以影响吗啡镇痛作用的mPD-PK模式特征,吗啡对不同疼痛刺激模式镇痛作用时效的不同取决于体内游离和结合吗啡浓度-时-效特征的不同,即吗啡的抗热痛反应镇痛时效作用表现为短时程速效模式(clockwise PK-PD model),而吗啡的抗机械痛反应镇痛时效作用表现为滞缓慢效模式(counter clockwise PK-PD model)。(2)除了疼痛的刺激模式之外,疼痛的状态也可以影响吗啡镇痛作用的mPD-PK模式特征。但不同的是,疼痛的状态不影响吗啡对不同刺激模式引起痛反应的浓度-时-效特征模式,但却显著影响吗啡在体内的吸收等相关药代动力学参数和游离吗啡-受体、结合吗啡-受体的亲和力或内在活性。外周炎症和神经损伤均可能加快游离吗啡的吸收时间,但是只有外周炎症才可以加快血液吗啡的代谢过程。在不同刺激模式和痛状态下,吗啡-受体的亲和力或内在活性发生显著改变。(3)吗啡抗热痛反应的镇痛作用可能主要取决于血液中的游离和结合吗啡的作用,而吗啡抗机械痛反应的镇痛作用可能主要取决于脑脊液(跨血脑屏障进入脑脊髓组织)中结合和游离吗啡的作用。(4)该研究结果首次提出疼痛刺激模式和疼痛的状态可能显著影响吗啡在体内的吸收等相关药代动力学参数,同时还可能影响体内游离和结合吗啡与受体的亲和性或内在活性,因此筛选和研制镇痛药需要应用mPD-PK结合模型。