目的：　　 急性白血病是威胁人类健康的常见血液肿瘤之一。目前化疗仍是治疗急性白血病的主要手段，而白血病细胞对于化疗药物产生耐药性则是化疗失败和临床复发的主要原因。干细胞移植是治疗白血病的另一个主要手段，然而移植物中残存的耐药肿瘤细胞往往导致自体移植失败或缓解后复发。因此探索新的克服、逆转耐药的方法非常重要。　　 5-氨基乙酰丙酸(5-Aminolevulinic acid，5-ALA)介导的光动力治疗(photodynamic therapy，PDT)是一种较新型的肿瘤治疗手段，利用肿瘤细胞对ALA产生的内源性光敏剂原卟啉Ⅸ(PpⅨ)的优先摄取，使肿瘤细胞在受到一定的光照后被选择性地杀伤。基于光动力疗法的净化技术较其他净化方法的优势在于对肿瘤细胞的选择性杀伤，以最大程度地减少对正常前体细胞及干细胞的损伤。因此ALA-PDT在白血病自体移植物体外净化中具有潜在的应用价值。已有研究显示ALA-PDT在白血病细胞中具有诱导凋亡作用，但到目前为止，ALA-PDT引起肿瘤细胞破坏的确切机制尚未完全阐明。在白血病耐药中的研究尚鲜见报道。　　 本课题通过对ALA-PDT致白血病细胞及耐药株凋亡的研究，将有助于深入了解ALA-PDT对白血病细胞增殖、凋亡及其信号传导途径的调控，较全面的阐述ALA-PDT在白血病及耐药中的潜在应用价值，将为ALA-PDT这一新的治疗手段最终应用于临床提供理论依据。　　 方法：　　 1.利用生长曲线、MTT法测定细胞增殖，对ALA的浓度、孵育时间及光的能量密度等有关ALA-PDT实验条件选择方面进行初步探讨。　　 2.利用MTT法检测ALA-PDT对HL-60及其耐药株HL-60/ADR细胞增殖的影响；应用瑞氏染色光学显微镜和透射电镜观察细胞形态，采用磷脂结合蛋白Ⅴ(AnnexinⅤ)+碘化丙锭(PI)双染法通过流式细胞术检测凋亡细胞的比例，并用共聚焦激光显微镜观察凋亡细胞形态。　　 3.采用阳离子脂质荧光探针JC-1(5,5,6,6-tetrachloro-1,1,3,3-tetraethyl-benzimidazol-carbocyanine iodide，四氯四乙基苯并咪唑羰花青)检测ALA-PDT前后两种细胞株线粒体跨膜电位的变化。　　 4.半定量逆转录酶-多聚酶链式反应及Real time PCR检测ALA-PDT对两种细胞株Bcl-2 mRNA表达的调控，同时还检测了ALA-PDT对HL-60/ADR细胞株中耐药相关基因MRP mRNA表达的调控。　　 5.利用基因芯片技术，从全基因组水平研究ALA-PDT对HL-60及HL-60/ADR细胞基因表达谱变化，探讨ALA-PDT对两种细胞可能的作用机制。　　 6.利用MTT法检测细胞增殖研究ALA-PDT在原代白血病细胞及正常单个核细胞(MNC)中的作用。　　 结果：　　 1.观察ALA-PDT对HL-60及HL-60/ADR细胞株增殖的影响中最适实验条件为：ALA浓度1mM、避光孵育4h后，以波长630nm、能量密度为18J/cm2的光照射。　　 2.ALA-PDT对两种细胞增殖和凋亡的影响：ALA-PDT后两种细胞株增殖均受到抑制，48h较24h更明显。常规应用瑞氏染色光镜及透射电镜观察细胞形态，两种细胞均发生了核固缩、凋亡小体等典型的凋亡改变；采用AnnexinV检测凋亡细胞比例随时间延长而随之增加，HL-60细胞在ALA-PDT后4h凋亡细胞比例与对照组比较有显著差异(P值＜0.05)；而HL-60/ADR细胞在3h凋亡细胞比例与对照组比较有显著差异(P值＜0.05)；在两种细胞株间比较，仅在4h时HL-60细胞凋亡率显著高于HL-60/ADR细胞(P值＜0.05)，而3h、24h比较两种细胞株无显著差异。在AnnexinV/FITC-PI染色后激光共聚集显微镜观察到了典型的早期凋亡和晚期凋亡形态。两种细胞株的单纯ALA组、单纯光照组与对照组比凋亡细胞比例均无显著差异(P值＞0.05)。　　 3.阳离子脂质荧光探针JC-1显示：ALA-PDT后HL-60和HL-60/ADR两种细胞株线粒体跨膜电位崩塌的细胞比例明显升高，光照结束即刻(0h)分别升高至58.28％±0.92％和55.91％±2.60％，随时间延长，这种细胞比例逐步增多，呈一定的时间依赖性。显示线粒体跨膜电位下降的发生早于形态学改变，也早于磷酯酰丝氨酸暴露于细胞表面。　　 4.RT-PCR及Real time PCR均显示：ALA-PDT能下调HL-60及HL-60/ADR细胞Bcl-2基因的表达，而HL-60/ADR细胞耐药相关基因MRP也有明显下调。　　 5.Illumina人全基因组芯片共检测了48，000个基因，用RT-PCR的方法验证了数据的可靠性，对芯片结果产生的数据分析发现：ALA-PDT影响了细胞的多种生命进程，如转录调控，抑制翻译过程；促进一系列应激反应；上调促凋亡基因的表达，抑制抗凋亡基因的表达，促进凋亡的发生。　　 6.正常骨髓MNC的ALA+PDT组在接受18J/cm2的光照剂量时细胞生长无明显抑制。脐血MNC的ALA+PDT组在接受18～54J/cm2的光照剂量下，细胞存活率与对照组比较无显著差异。ALA-PDT对急性白血病原代细胞显示有不同程度的杀伤，初发和复发难治组光动力效应分别为53.40％±13.33％和62.42％±39.66％(24h)，64.11％±17.71％和68.78％±30.30％(48h)，初发和复发难治组比较无显著差异。　　 小结：　　 1.ALA介导的PDT能诱导白血病细胞株HL-60及其耐药株HL-60/ADR凋亡，呈一定的时间依赖性。　　 2.ALA介导的PDT诱导的细胞凋亡可改变线粒体膜电位，下调Bcl2基因表达，膜电位的改变早于细胞形态和磷酯酰丝氨酸暴露于细胞表面，提示凋亡与线粒体的结构和功能有关。　　 3.ALA-PDT介导的HL-60/ADR细胞中耐药基因CIAPIN1、MRP、Bcl2基因的下调，可能是ALA-PDT能逆转/克服耐药的因素之一。多药耐药细胞株HL-60/ADR与ALA-PDT无交叉耐药。　　 4.多种调控机制参与凋亡的发生：HL-60/ADR细胞中线粒体途径和Fas途径的激活，主要是DEDD2及CDC2L2介导的凋亡通路占主要地位，其中FLASH、Bcl2、PAK1、E1B19K等基因参与其中促进凋亡的发生。HL-60细胞中c-Abl、PML、C-MYC基因是上调基因网络中的主导基因，共同参与了凋亡的发生。线粒体途径和TNF途径激活，DEDD2及CDC2L2介导的凋亡通路也占了一定的地位。ERN1、FEMIB、RIP1、DAPK3、Api5、Bcl2、BAR、survivin等基因参与其中促进凋亡的发生。c-Jun基因转录激活诱导的凋亡途径可能共同参与了两种细胞株的凋亡机制。　　 5.ALA-PDT可以杀伤原代白血病细胞，而相同剂量下对正常单个核细胞几乎无影响，显示一定的肿瘤选择性。