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调宁蛋白是一个具有多种功能的蛋白家族,与许多疾病的发生发展都有密切联系。碱性调宁蛋白( h1-calponin)属于调宁蛋白家族,近年研究发现h1-calponin与骨骼发育及疾病有密切关系。骨骼形成主要通过软骨内成骨和膜内成骨两种方式来完成。其中骨组织形成的基本过程一致,即间充质干细胞增殖和密集后分化为成骨细胞,成骨细胞分泌类骨质,并被包埋其中,成为骨细胞,继而类骨质钙化成骨基质,最后形成骨组织[1 2]。h1-calponin是调宁蛋白家族成员之一,目前对其在骨发育领域研究较少。h1-calponin基因敲除小鼠可出现软骨及骨形成加快,骨量增加,提示h1-calponin对骨形成具有调节作用。在骨折愈合中, h1-calponin敲除小鼠依靠活化的骨膜成骨细胞的大量增生使得新骨形成增加[3]。这些均提示h1-calponin可能是骨形成的负性调节分子,但具体机制不明。h1-calponin作为参与骨骼发育过程的一种因子,目前研究较少。既往利用基因敲除小鼠研究h1-calponin在骨发育中的作用,极大地增加了我们对其在骨发育中作用的认识,但利用传统基因敲除小鼠不能明确h1-calponin对成骨细胞是直接发挥作用来影响骨形成,还是通过对软骨细胞的间接调控骨形成,且h1-calponin本身的作用机制亦不明确。据此,本研究计划构建成骨细胞中特异性过表达h1-calponin转基因小鼠模型(colI-calponin),通过对该小鼠的骨骼表型分析,并结合体外成骨诱导实验,研究h1-calponin对小鼠成骨细胞功能的调节作用,明确其对成骨细胞的直接作用并探讨其分子机制。主要实验方法:第一部分:colI-calponin转基因小鼠的建立及验证1、从小鼠肾脏中扩增出h1-calponin的cDNA,使用collage I启动子,采用SK质粒作为骨架,分别将h1-calponin的cDNA和colI promoter,SV40 polyA装入SK骨架中,并用SalI和SacII两种限制性内切酶将构建好的载体线性化,经纯化后显微注射入小鼠受精卵中。2、出生小鼠的基因型鉴定:小鼠剪尾后提取基因组DNA,然后采用PCR鉴定小鼠基因型。3、colI-calponin小鼠与FVB小鼠交配,得到既有colI-calponin,又有野生型的同窝小鼠,根据性别进行分组。4、分离培养原代小鼠成骨细胞,提取总RNA,RT-PCR检测colI-calponin及WT小鼠中h1-calponin的表达水平差异。5、提取colI-calponin及WT小鼠各组织总RNA,RT-PCR检测h1-calponin的表达情况,制作表达谱,验证转基因小鼠成骨细胞表达的特异性。第二部分:h1-calponin对小鼠成骨细胞功能的调节作用及机制的初步研究1、对出生后不同时期(间隔为1周)的colI-calponin转基因小鼠进行大体观察(身长、体重、外表特征等),与同窝同性别WT小鼠对比分析。2、利用X线摄片、双能骨密度计和Micro-CT观察成年小鼠股骨骨密度及骨组织结构的变化。用三点折断法检测其生物力学特性,并对小鼠血清中钙、磷含量进行测定。3、全骨架染色并结合组织切片,全骨架染色(阿辛蓝+茜素红)大体观察骨骼发育;并对2月龄、4月龄小鼠(WT/colI-calponin)胫骨进行组织学切片、染色(HE)来对比观察小鼠胫骨的结构情况。4、分离培养原代成骨细胞,并采用细胞计数法绘制生长曲线以及BrdU标记检测小鼠成骨细胞增殖情况。5、对分离培养的原代成骨细胞进行成骨诱导,通过碱性磷酸酶测定,结合成骨相关基因的表达检测,观察成骨细胞分化情况。6、对成骨诱导的原代成骨进行茜素红染色观察矿化情况。7、对原代成骨细胞采用Western Blot检测其Erk1/2磷酸化水平。主要实验结果:一、成功构建成骨细胞特异性过表达h1-calponin转基因小鼠(colI-calponin)1、通过提取小鼠基因组DNA,并采用PCR检测证实h1-calponin cDNA成功插入于突变小鼠基因组中。2、通过RT-PCR检测colI-calponin及WT小鼠成骨细胞中h1-calponin的表达水平,证实colI-calponin小鼠成骨细胞中h1-calponin表达较WT小鼠显著性增高。且通过观察colI-calponin及WT小鼠各组织h1-calponin表达谱,证实h1-calponin在成骨细胞中的特异性过表达。二、colI-calponin小鼠成年期骨量减少,骨重建异常,Erk活性增强在其中起重要作用1、colI-calponin小鼠体重明显减轻,成年期骨量减少,骨皮质生物力学性能改变,血清中钙磷含量无明显变化。2月和4月龄的colI-calponin小鼠股骨骨密度降低,骨小梁数量减少,分离度降低;骨皮质厚度减小,反映其生物力学特性的最大值弯曲载荷和弹性模量均增加,但其血清中钙磷含量则无明显差异。2、colI-calponin小鼠成骨细胞增殖减弱2月和4月龄的colI-calponin小鼠胫骨骨小梁稀疏。成骨细胞生长曲线及BrdU标记结果均提示colI-calponin小鼠成骨细胞增殖能力减弱。3、colI-calponin小鼠成骨细胞分化与矿化能力减弱检测成骨诱导7天、14天、21天的成骨细胞分化标志基因,结果显示colI-calponin小鼠成骨细胞碱性磷酸酶表达减弱;OP表达下调;OC表达显著性下调。茜素红染色检测成骨诱导14天、21天成骨细胞,结果显示colI-calponin小鼠成骨细胞钙结节形成明显减少,矿化降低。5、colI-calponin小鼠成骨细胞Erk1/2磷酸化蛋白水平明显增加Western Blot检测colI-calponin小鼠成骨细胞中Erk1/2磷酸化蛋白水平明显增加,提示colI-calponin小鼠成骨细胞增殖、分化和矿化能力的改变可能是由Erk1/2信号途径活化增强引起的。主要结论:1、成功构建成骨细胞特异性过表达h1-calponin转基因小鼠模型。2、成骨细胞特异性过表达h1-calponin转基因小鼠成年期骨量下降由其成骨能力改变引起。3、成骨细胞异性过表达h1-calponin抑制成骨细胞增殖;通过下调ALP、OP和OC表达从而抑制成骨细胞分化成熟,抑制成骨细胞矿化,而这些作用可能或部分是通过激活Erk1/2信号通路实现的。