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多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是一种复杂的、异质性内分泌紊乱综合征,以高雄激素血症、高胰岛素血症、胰岛素抵抗和持续性无排卵为主要特征。PCOS患者的临床表现多样,其近期和远期并发症对女性的身心健康影响较大。据报道,PCOS是无排卵性不孕的最常见原因,另外PCOS患者2型糖尿病、心血管疾病和子宫内膜癌的发病风险与非PCOS患者相比明显升高。鉴于PCOS对女性健康的巨大危害,对其发病机制的研究已经成为全球妇科内分泌专家关注的焦点。目前认为PCOS可能的致病原因包括雄激素生成过多、下丘脑垂体功能紊乱、胰岛素抵抗、细胞凋亡及卵泡发育异常等,其中细胞凋亡和卵泡发育异常导致PCOS发病的理论受到越来越多学者的关注,但是具体的发病机制尚需要进一步挖掘。微小RNA(micro RNA,mi RNA)是一类内源性单链、非编码的小分子RNA,一般长度为18-24核苷酸,通过与其靶基因3’非编码区(untranslated region,UTR)结合,在转录后水平负性调控其靶基因。近年来,人们发现mi RNA在子宫、输卵管、卵巢等女性生殖器官中均有表达,并广泛参与调控女性卵泡发育成熟、受精、着床及胚胎发育等生理过程,对维持女性正常生育功能起重要作用。同时研究还发现,mi RNA的异常表达可能与很多女性疾病的发生有关,如PCOS患者卵泡颗粒细胞中的mi RNA存在异常表达,而其中一部分mi RNAs(如let-7a、let-7i和mi R-92b)的异常表达可能与卵泡颗粒细胞凋亡有关。由此可见,mi RNA可能通过影响颗粒细胞凋亡,进而导致PCOS的发生。本研究的目的在于揭示对PCOS发病起关键作用的mi RNA及其导致疾病发生的调控作用机制。由于PCOS患者颗粒细胞取材困难,因此本研究构建了PCOS大鼠模型,借助mi RNA深度测序、荧光定量PCR、Western Blot、基因转染和双荧光素酶报告基因检测等实验技术,挖掘可能与PCOS疾病发生相关的mi RNAs及其下游调控通路。主要研究内容如下:1.PCOS大鼠模型的构建我们采用来曲唑灌胃法建立PCOS大鼠模型。PCOS模型组:每日将来曲唑按1mg/(kg?d)溶解到1%羧甲基纤维素(CMC)中,连续23天灌胃处理;对照组:每日CMC 1mg/(kg?d),连续23天灌胃处理。结果:来曲唑灌胃处理后,大鼠阴道涂片显示,对照组大鼠存在规律的动情周期变化,而模型组大鼠的动情周期失去规律性变化,模型组大鼠的阴道涂片可见大量白细胞,提示大鼠持续处于动情间期。卵巢组织HE染色显示模型组卵巢结构紊乱,卵巢内囊状扩张的卵泡增多、黄体及发育阶段卵泡数目明显减少。ELISA检测显示,模型组大鼠血清LH、FSH、T浓度显著高于对照组,E2浓度显著低于对照组。以上实验数据说明我们成功构建了PCOS大鼠模型。2.深度测序及生物信息学分析提取PCOS模型组与对照组大鼠卵巢组织的总RNA,经深度测序后发现,显著差异表达的mi RNAs共有129个,其中表达上调的mi RNAs有49个,表达下调的mi RNAs有80个。选取4个与细胞增殖、凋亡相关的mi RNAs进行验证,荧光定量PCR结果显示,mi R-34b-5p、mi R-141-3p和mi R-200a-3p在模型组大鼠卵巢组织中呈显著性下调,而mi R-201-5p在模型组大鼠卵巢组织中呈显著性上调,进一步验证了深度测序结果的准确性。随后利用生物信息学软件对4个差异表达mi RNAs进行下游靶基因预测,共发现2060个靶基因。运用Gene Ontology(GO)、Pathway analysis等软件对这些靶基因的潜在下游调控通路进行富集和筛选,发现4个差异表达mi RNAs的靶基因参与卵母细胞减数分裂、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、Rap1信号通路及Notch信号通路、生殖过程和细胞凋亡等多条信号通路。3.选取mi R-141-3p进行功能验证mi R-141-3p在PCOS模型组卵巢中的表达水平呈显著性下调。MTT法显示,过表达mi R-141-3p后,细胞活力明显增强;干扰mi R-141-3p功能后,细胞活力明显减弱。流式细胞术显示,过表达mi R-141-3p后,细胞促凋亡的能力明显减弱;干扰mi R-141-3p功能后,细胞促凋亡的能力明显增强。生物信息学分析软件预测结果显示死亡相关蛋白激酶1(death-associated protein kinase,DAPK1)的3’-UTR区含有可与mi RNA-141-3p互补结合的序列,DAPK1可能是mi R-141-3p的靶基因。荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,模型组大鼠卵巢中mi R-141-3p显著性下调,而DAPK1显著性上调,二者在PCOS大鼠卵巢中的表达呈明显负相关。使用mi R-141-3p模拟剂和抑制剂转染大鼠卵巢颗粒细胞后,DAPK1 m RNA和蛋白水平均与mi R-141-3p表达水平呈负相关。双荧光素酶报告基因实验显示,当HEK 293T细胞转染含Wt-DAPK1 3’-UTR的荧光素酶报告载体时,mi R-141-3p模拟剂组的荧光素酶活性较对照组明显降低;而当HEK 293T细胞转染含Mut-DAPK1 3’-UTR的荧光素酶报告载体时,mi R-141-3p模拟剂组和对照组的荧光素酶活性无显著性差异。上述结果表明,mi R-141-3p能与DAPK1基因3’-UTR结合,并对DAPK1转录有负性调控作用,证实DAPK1是mi R-141-3p的靶基因。结果表明,PCOS大鼠模型卵巢中mi RNA的异常表达可能是引起PCOS发病的重要原因。PCOS大鼠模型卵巢中低表达的mi R-141-3p通过靶向调控DAPK1的表达,进而在PCOS发生发展中发挥促进细胞凋亡的作用,mi R-141-3p/DAPK1有望成为新的PCOS诊断标志物和治疗靶点。