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血管生成素样蛋白(Angptls)是最新发现的一类分泌性糖蛋白,因具有与血管生成素相似的结构特征而命名,在功能上不仅与血管生成有关,而且与脂类代谢、糖类代谢和胰岛素敏感性密切相关,尤其是Angptl3、Angptl4和Angptl6对糖、脂代谢的调节引起了广泛的关注。羊妊娠毒血症也称为羊酮病,是一种糖类和脂类代谢紊乱性疾病,多发于妊娠末期怀多羔母羊,常规治疗大多无效,患病母羊死亡率达60%-70%。目前,对羊妊娠毒血症的发病机制尚不清楚。对Angptls的研究,主要集中在人和小鼠,尚未见有关羊Angptls的报道。为研究Angptl3、Angptl4、Angptl6是否与羊妊娠毒血症的发病机制相关,并探讨天然抗氧化剂厚朴酚、白藜芦醇等对原代羊肝细胞上述基因表达的调控作用,本研究以浏阳黑山羊(以下简称羊)为材料克隆了Angptl3、Angptl4、Angptl6和酮体合成关键酶HMGCS2cDNA,通过禁食人工诱导羊妊娠毒血症,再恢复饲喂促进患羊康复,研究了上述基因在正常羊、妊娠毒血症患羊和康复羊肝脏中的表达变化,并分离培养了羊原代肝细胞,初步研究了天然抗氧化剂厚朴酚、和厚朴酚、表没食子儿茶素没食子酸酯((-)-epigallocatechin gallate, EGCG)、白藜芦醇、苹果多酚和黄芩苷等对羊原代肝细胞上述基因表达的调控,以期从分子水平研究羊妊娠毒血症的发病机制,并为防治羊妊娠毒血症提供新的思路。1.Angptl3、Angptl4、Angptl6和HMGCS2cDNA的克隆利用RT-PCR、3’RACE和5’RACE方法,扩增并拼接得到羊Angptl3全长cDNA序列1508bp,包括54bp的5’端非编码区,1380bp的编码区和74bp的3’端非编码区,编码区编码459个氨基酸；得到Angptl4cDNA部分序列1395bp,其中编码区861bp,编码286个氨基酸；得到Angptl6cDNA部分序列1108bp,其中编码区819bp,编码272个氨基酸；得到HMGCS2cDNA全长序列共2040bp,其中开放阅读框1527bp,编码508个氨基酸；所获序列已提交GenBank, Angptl3、Angptl4、Angptl6和HMGCS2注册号分别为GQ293360、HQ008534、HQ008535和GU586190。2.羊妊娠毒血症的诱导和恢复妊娠末期怀双羔的母羊禁食不禁水72h,血清β-羟丁酸(β-hydroxybutyric acid, BHBA)、游离脂肪酸极显著升高(P<0.001),血糖极显著降低(P<0.001),甘油三脂无显著变化,肝脏呈脂肪病变,血浆脂蛋白酯酶活性显著降低(P<0.05),胰岛素水平显著降低(P<0.05),可的松水平显著升高(P<0.05),血液生化指标结合临床症状观察表明,禁食72h成功诱导了母羊中度妊娠毒血症。恢复饲喂5d,上述指标逆转,妊娠毒血症临床症状逐渐消失,结果表明母羊康复。3.羊肝脏Angptl3、Angptl4、Angptl6和HMGCS2mRNA的表达根据已获得的羊Angptl3、Angptl4、Angptl6和HMGCS2的cDNA序列设计荧光定量引物,采用Real-time PCR方法研究了正常羊、妊娠毒血症羊和康复羊肝脏中上述基因的表达差异。结果表明,与正常羊相比,伴随着血BHBA、游离脂肪酸升高,患羊肝脏Angptl3表达极显著下调(P<0.01)、Angptl3表达极显著上调(P<0.01)、Angptl6表达极显著下调(P<0.01),酮体生成的关键酶HMGCS2表达极显著上调(P<0.001),恢复饲喂促进动物康复后,上述各基因表达水平逆转,结果表明Angptl3、Angptl4、 Angptl6可能与羊妊娠毒血症的发生发展相关。4.羊原代肝细胞的分离和培养采用胶原酶灌注法分离得到羊原代肝细胞,台盼蓝拒染实验测定总细胞数和肝细胞即时存活率,肝细胞以5×105个/mL接种于培养瓶,测定培养基上清液中乳酸脱氢酶、尿素和白蛋白水平。结果显示,从每克肝组织可获得(8.65±0.43)×106个肝细胞,肝细胞即时存活率为(92.86±4.42)%,培养4-5d的肝细胞生长状态最好,适合用于肝细胞基因表达的研究。5.天然抗氧化剂对羊原代肝细胞Angptl3、Angptl4、Angptl6和HMGCS2mRNA表达的影响以分离培养的原代肝细胞为材料,初步探讨了天然抗氧化剂厚朴酚、和厚朴酚、EGCG、白藜芦醇、苹果多酚、黄芩苷对羊原代肝细胞Angptl3、Angptl4、Angptl6和HMGCS2mRNA表达的影响。结果表明,厚朴酚(10、20、40μmol/L)、和厚朴酚(10、20、40μmol/L)、白藜芦醇(10、20、40μmol/L)、苹果多酚(15、30、60mg/L)黄芩苷(20、40、80mmol/L)均能下调Angptl3、Angptl4、Angptl6和HMGCS2mRNA表达,EGCG (40、20、10μmol/L)上调羊原代肝细胞Angptl4表达,下调Angptl3、 Angptl4、Angptl6和HMGCS2表达、上述天然抗氧化剂对Angptl3、Angptl6、 HMGCS2表达的调节作用可能成为防治羊妊娠毒血症的新思路。