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第一部分菌体胞外蛋白可作为MTB和NTM诊断与鉴别诊断的免疫原性标识物的筛选目的 筛选和鉴定结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)、非结核分枝杆菌(Non-tuberculous Mycobacteria,NTM)相应的免疫原性蛋白,发现可用于结核病和非结核分枝杆菌病诊断与鉴别诊断的适宜诊断标识物。为新诊断方法的开发提供潜在的标识物,为结核病和非结核病的诊断和鉴别诊断寻找新途径。方法 选择结核分枝杆菌标准菌株H37Rv和5种最常见的致病NTM标准菌株(包括3种慢生长分枝杆菌:堪萨斯分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌株;2种快生长分枝杆菌:偶发分枝杆菌和脓肿分枝杆菌)进行研究。收集菌株培养滤液中的蛋白,浓缩后进行酶解处理,对蛋白样本评估后、利用Label free蛋白质组学技术对肽段进行鉴定,基于UniProt数据库搜库检索,在SignaIP服务器中对蛋白质的信号肽进行查找,以筛选膜相关蛋白或分泌蛋白。结合SWISS-MODEL建立三维模型,在IEDB数据库中对这些胞外蛋白的T细胞抗原表位和B细胞抗原表位进行预测。同时,通过生物信息学分析对胞外蛋白的GO功能注释和KEGG通路注释进行富集,对比不同NTM菌种和结核分枝杆菌在胞外蛋白功能和参与通路方面的差异性。结果 1.结核分枝杆菌和3种慢生长NTM菌株之间的滤液蛋白表达模式基本一致,但2种快生长NTM的滤液蛋白与慢生长分枝杆菌间存在较大差异。结核分枝杆菌特异性表达的胞外蛋白中获得20个抗原性蛋白;堪萨斯分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、偶发分枝杆菌和脓肿分枝杆菌获得免疫原性蛋白数目分别为27、32、52、26和2个。2.NTM与MTB的胞外蛋白功能差异主要集中于一些重要的生物功能,如跨膜转运、转运酶和水解酶活性、膜锚定的转运蛋白等方面。其中2种快生长NTM偶发分枝杆菌和脓肿分枝杆菌蛋白在铜离子转运和铜离子稳态方面有别于其他菌株,而且有关羧肽酶活性的分子功能也与结核分枝杆菌有明显差异。3.通过对KEGG通路富集发现:相对于结核分枝杆菌,鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌中缺失LprA和LprG蛋白,偶发分枝杆菌和脓肿分枝杆菌缺失LprA、LprG和PstS同源蛋白。结论 1.结核分枝杆菌LprA、LprG和PstS的同源蛋白可能与不同菌株致病性有关,有可能作为结核病和NTM病诊断与鉴别诊断的分子标识物。2.快生长分枝杆菌和慢生长分枝杆菌在铜离子转运以及羧肽酶活性方面存在的差异可能与菌株的致病性、毒力以及菌株生长有关,有可能作为结核病和NTM病诊断鉴别诊断的候选标识物。第二部分MTB和NTM体外感染巨噬细胞来源的外泌体蛋白组学分析目的 对结核分枝杆菌和上述5种常见致病性非结核分枝杆菌感染巨噬细胞后分泌的外泌体蛋白进行研究,从宿主相关蛋白的角度筛选可作为结核病和非结核分枝杆菌病诊断的候选标识物,为难以获取细菌学依据的结核病和非结核分枝杆菌病的诊断和鉴别诊断寻找线索。方法 分别用结核分枝杆菌和5种非结核分枝杆菌标准株(堪萨斯分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌标、偶发分枝杆菌和脓肿分枝杆菌)对THP-1巨噬细胞进行感染,超速离心法富集细胞上清中的外泌体,对外泌体蛋白鉴定后进行Label free质谱检测,筛选宿主细胞相关的蛋白进行分析。对各个感染组特异性表达的外泌体蛋白在UniProt数据库检索进行亚细胞定位,筛选有细胞黏附作用的膜蛋白。同时通过生物信息学手段对组间存在差异表达的外泌体蛋白进行GO功能富集和KEGG通路富集,对差异性蛋白的功能特点和参与的主要通路进行分析,并筛选通路中的关键差异蛋白。结果 1.对所有感染组与未感染组的外泌体蛋白组成进行比较发现,各组共有蛋白的数目占所有鉴定蛋白总数的51.14%(1771/3461),提示各组共有蛋白比例高。2.结核分枝杆菌感染组与3种慢生长的NTM感染组的外泌体中均鉴定到1-3个与细胞黏附有关的宿主蛋白,但2种快生长NTM感染组中未鉴定到此类蛋白。3.鉴定到菌体来源的外泌体蛋白Icd2、pepA、DnaK、IprA、GlcB、KatG在同类研究中有报道。4.在KEGG通路富集中得到29个参与受体信号转导的重要蛋白,这些蛋白的功能包括JAK-STAT信号通路、Toll-NFκB/MAPK通路,以及与抑制宿主细胞凋亡和吞噬溶酶体成熟的信号转导通路。其中Myd88在结核分枝杆菌和堪萨斯感染组有表达,且在结核分枝杆菌组表达显著增高(P<0.01)。结核分枝杆菌感染组分离到可促进Akt/PKB通路抑制细胞凋亡的AKT1蛋白,偶发分枝杆菌感染组中分离到可促进宿主细胞凋亡的Bax蛋白。结论1.各组巨噬细胞的外泌体蛋白差异可提示宿主细胞是否存在分枝杆菌的感染以及所感染分枝杆菌的菌种。外泌体蛋白成分的差异可能在分枝杆菌诊断与鉴别诊断中发挥作用。2.筛选到的细胞膜锚定蛋白可能在结核分枝杆菌和慢生长NTM菌株致病中起重要作用。3.分枝杆菌感染巨噬细胞后阻碍吞噬体和溶酶体结合,可能是分枝杆菌胞内存活的共同机制。相较于NTM感染组,结核分枝杆菌感染过程中对Myd88信号传导作用的依赖性更强。第三部分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌感染巨噬细胞后释放细胞因子的差异研究目的 了解结核分枝杆菌和上述5种NTM体外感染巨噬细胞后细胞因子的不同表达情况,为建立快速、简便地鉴别结核分枝杆菌和不同菌种非结核分枝杆菌的方法提供依据。方法 选择 IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12/23 p40、IL-27、TNF-α、IP-10、MCP-1等11个因子作为研究对象。分别用MTB标准菌株H37Rv和5种NTM标准菌株(堪萨斯分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、偶发分枝杆菌、脓肿分枝杆菌)感染巨噬细胞,在感染后4小时、8小时、24小时和48小时收集细胞培养上清,Luminex液相芯片方法检测多因子表达水平。同时用LDH法对巨噬细胞的存活率进行测定,CFU计数对巨噬细胞内分枝杆菌的生长情况评估,并在结核病患者、NTM病患者和健康志愿者血浆中进行验证。综合分析筛选可能用于结核病与NTM病诊断以及鉴别诊断的细胞因子组合。结果 1.结核分枝杆菌感染细胞组、NTM菌株感染细胞组与未感染对照组进行比较发现:各分枝杆菌感染组IP-10表达量均高于未感染组,且在各个分枝杆菌感染组均有不同程度增高。结核分枝杆菌、堪萨斯和胞内分枝杆菌感染组释放的IL-6表达量升高,而鸟分枝杆菌和2个快生长菌株感染组无明显增高。结核分枝杆菌感染后释放的IL-10与NTM感染组和未感染组均有显著性差异。结核分枝杆菌感染组的IL-12/23p40与5种NTM感染组比较有显著增高。IL-4、IFN-γ和MCP-1在感染组和未感染组无明显差别。TNF-α在感染组表达水平降低。IL-2和IL-2R-α表达量低于检测下限。2.结核病患者、NTM病患者(鸟分枝杆菌病、胞内分枝杆菌病和脓肿分枝杆菌病)与健康志愿者患者血浆细胞因子表达水平进行比较:结核病患者和3组NTM病患者的TNF-α、MCP-1、IL-2R-α和IL-6水平均显著高于健康志愿者组,且3组NTM病患者之间的TNF-α水平也有显著性差异。IL-2、IL-4、IL-12/23p40和IFN-y在结核病患者组较健康志愿者显著增高。结论 1.在巨噬细胞感染模型中,IP-10和IL-10可以区分结核分枝杆菌和NTM感染,IP-10还可以区别所感染的NTM菌种。IL-6和IL-12/23p40在结核分枝感染后表达上升,和NTM感染组有显著差异。TNF-α表达水平可区别分枝杆菌感染和未感染组。2.不同种分枝杆菌感染巨噬细胞的应答模式不同,细胞因子在不同菌株感染中的表达模式有差异性,可能与细菌的毒力和致病能力有关。IL-6、IL-12/23p40和TNF-α有望在体外和体内用作鉴别不同菌种感染的诊断指标。