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目的:脑死亡供肝为终末期肝病患者的新生带来了希望,对脑死亡供体器官进行适当维护可最大限度的利用紧缺的器官资源。氢气的生物学作用研究近年来是医学领域比较热门的一个课题,其选择性抗氧化、抗炎症的特性如今已在临床得到初步的应用,但是目前几乎没有关于氢气对脑死亡大动物器官维护的研究。本研究旨在通过间断缓慢颅内加压法建立五指山小型猪的脑死亡模型,并予富氢盐水(HS)进行干预治疗。检测脑死亡五指山小型猪经HS干预治疗后血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)水平,肝组织中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量,以及NF-κB p65、Nrf2、HO-1的表达情况,并观察肝组织标本光镜及电镜下的变化。探讨HS对脑死亡肝脏损伤的干预作用及其机制,为脑死亡供肝的维护提供理论支持。方法:选择健康雄性五指山小型猪18只,随机分为三组(n=6):假手术组(K组)、脑死亡组(B组)、HS干预组(H组)。动物经麻醉诱导后依次行气管插管、膀胱造瘘、颈动静脉置管、颅骨钻孔置入20F Foley气囊导管。B组、H组建立脑死亡模型,并维持其脑死亡状态24h。K组仅颅内置入水囊,不建立脑死亡模型,维持麻醉状态;H组动物从判断脑死亡开始,于上腔静脉输入HS,B组输入当量的生理盐水。B组、H组在初判脑死亡后3h、6h、12h、18h、24h分别采集血液及肝组织标本。K组以颅内置管后3h作为起始时间,在起始时间点后3h、6h、12h、18h、24h分别采集血液及肝组织标本。血清标本检测AST、ALT浓度,HE染色观察肝组织病理学改变,电镜观察肝组织超微结构改变;用相应试剂盒检测肝组织中MDA、SOD含量;酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定血清炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平;DAB免疫组织化学染色检测各组肝组织内6h、12h、24h,三个时间点的NF-κB p65蛋白以及Nrf2、HO-1的表达水平差异。利用Western bolt检测肝内6h、12h、24h,NF-κBP65分子的表达量以及Nrf2、HO-1蛋白表达量。用SPSS 20.0软件处理数据,所有数值变异均采用(x±S)表示,采用重复数据方差分析、单因素方差分析进行数据处理,P<0.05为差异有显著性意义。结果:1血清AST、ALT测定K组各时间点血清ALT、AST水平差异无显著性意义(P>0.05)。与K组相比,B组和H组血清AST水平自3h起逐渐升高(P<0.05),ALT水平自6小时起逐渐升高(P<0.05)。与B组相比,H组血清3h的AST、ALT水平无显著性差异差(P>0.05),6h起,H组血清AST、ALT水平显著低于B组(P<0.05)。2肝组织SOD、MDA测定2.1 SOD测定K组各时间点SOD水平差异无显著性意义(P>0.05)。与K组相比,3h、6h的B组、H组SOD值显著高于K组(P<0.05),12h、18h、24h的SOD值显著低于K组。同一时间点相比,H组SOD值显著高于B组(P<0.05)。2.2 MDA测定K组各时间点MDA水平差异无显著性意义(P>0.05)。自首次判定脑死亡后3h起,B组和H组肝组织MDA水平逐渐升高(P<0.05),相同时间点比较H组显著低于B组(P<0.05)。3血清IL-1β、IL-6、TNF-α测定K组各时间点血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平差异无显著性意义(P>0.05)。与K组相比,自首次判定脑死亡后3h起,B组和H组血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平逐渐升高(P<0.05),相同时间点比较H组显著低于B组(P<0.05)。4HE染色肝脏光镜下变化K组各时间点光镜下肝细胞形态结构基本正常,染色较均匀,到24h时细胞无明显坏死、水肿、空泡化等病理变化。B组于3小时起肝细胞有轻微肿胀,12h起细胞结构较紊乱、胞浆疏松,肝窦受压变窄且有淤血,胞质疏松淡染且有气球样变,汇管区有中性粒细胞浸润。H组相同时间点较B组肝细胞肿胀轻微,细胞结构相对规整,炎性细胞浸润较少,微循环通畅,肝窦淤血较轻。5透射电镜观察K组线粒体结构接近正常,随着时间增加仅见线粒体脊稍有增厚融合,内质网扩张不明显。B组自6h起可见部分线粒体脊不清晰,部分粗面内质网有颗粒融合、脱颗粒现象,细胞核结构正常。12h起可见线粒体水肿、空泡化,线粒体嵴部分消失,胞质水肿,核周隙增宽,粗面内质网颗粒融合。24h后可见大部分线粒体嵴和膜融合,核膜不清。H组相应时间点较B组线粒体结构形态更完整,脊清晰,且可见有自噬小体,说明细胞自我修复功能完整。6免疫组织化学检测6.1肝组织NF-κB p65检测K组各时间点NF-κB p65水平差异无显著性意义(P>0.05)。与K组相比,自首次判定脑死亡后6h起,B组和H组肝组织NF-κB p65水平逐渐升高(P<0.05),相同时间点比较H组显著低于B组(P<0.05)。6.2肝组织Nrf2、HO-1检测K组各时间点Nrf2、HO-1水平差异无显著性意义(P>0.05)。自首次判定脑死亡后6h起,B组和H组肝组织Nrf2、HO-1水平逐渐升高(P<0.05),相同时间点比较H组显著高于B组(P<0.05)。7Western bolt检测7.1肝组织NF-κB p65Western bolt检测K组各时间点NF-κB p65水平差异无显著性意义(P>0.05)。自首次判定脑死亡后6h起,B组和H组肝组织NF-κB p65水平逐渐升高(P<0.05),相同时间点比较H组显著低于B组(P<0.05)。7.2肝组织Nrf2、HO-1 Western bolt检测K组各时间点Nrf2、HO-1水平差异无显著性意义(P>0.05)。自首次判定脑死亡后6h起,B组和H组肝组织Nrf2、HO-1水平逐渐升高(P<0.05),相同时间点比较H组显著高于B组(P<0.05)。结论:1利用间断缓慢颅内加压法可成功建立五指山小型猪脑死亡模型,与临床脑死亡的发展过程具有相似性,通过有效的呼吸循环及血管活性药物等支持,能使脑死亡模型维持较长时间,可为脑死亡研究提供可靠的动物模型。2.五指山小型猪在脑死亡后肝组织NF-κB表达增加,血清炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α浓度升高,且抗氧化应激通路蛋白Nrf2/HO-1表达增加,组织T-SOD水平逐渐降低,氧化应激产物MDA逐渐升高。表明脑死亡后猪肝组织内有氧化应激及炎症反应存在。3.富氢盐水可阻断NF-κB的磷酸化激活,减少炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的释放,并上调Nrf2、HO-1的表达水平从而减轻脑死亡时肝组织的氧化应激及炎症反应造成的损伤,起到肝脏保护作用。