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幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是慢性胃炎和消化性溃疡的重要病因，与胃癌的发生密切相关[1]。世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)已将幽门螺杆菌列为Ⅰ级致癌因子[2]。全世界有平均50％的人口感染幽门螺杆菌，约有20％～30％的感染人口会渐渐发展为不同程度的胃炎、消化道溃疡或胃腺癌。 宿主感染细菌的临床结局与细菌毒力因素、宿主反应和环境因素有关。其中细菌本身的特性尤其是毒力因子可能起了关键作用[3]。目前较为关注的H.pylori与临床结局相关的毒力因子，主要包括cagA，vacA s1，oipA，babA2，dupA以及hrgA等，但这些毒力因子缺乏明确与胃癌相关的特异的流行病学标志，无法明确解释其致胃癌的机制[4，5]，新的与胃癌有关的毒力因子的研究将有助于进一步解释这些问题。 本室在前期研究中，采用抑制性消减杂交(SSH)以及斑点杂交的方法构建了H.pylori胃癌来源株和浅表性胃炎来源株差异基因文库，对筛选出的差异基因进行生物信息学分析，发现slyD基因为胃癌来源株的高拷贝基因，可能与胃癌发生发展密切相关[6]，其编码产物SlyD蛋白具有肽基-脯氨酰-顺反式异构酶(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase，PPIase)活性，属于PPIase-FKBP(FK506 binding protein)家族[7]。PPIase-FKBP在多种细菌中作为毒力因子参与微生物致病过程。嗜肺军团杆菌中(Legionella pneumophila)的Mip蛋白属于PPIase-FKBP家族，是该菌的重要毒力因子，协助细菌在细胞内生长繁殖，有效逃避宿主免疫机制攻击，其编码基因缺失突变的菌株感染单核细胞以及肺上皮细胞的能力显著下降[8]。类鼻疽伯克式杆菌(Burkholderia pseudomallei)的PPIase-FKBP可以协助细菌抵抗宿主免疫机制的杀灭，促进细菌周期性集群运动以及蛋白酶的产生，其编码基因缺失突变株毒力显著下降[9]。那么，SlyD是否也作为毒力因子参与H.pylori致病过程，以及H.pylori slyD确切的功能及生物学效应尚未可知。 目的： 本研究拟利用分子克隆技术，通过构建幽门螺杆菌SlyD原核表达载体，纯化SlyD蛋白，在此基础上，深入研究幽门螺杆菌SlyD的生物学效应及其作用机制，为探讨幽门螺杆菌致病机制及开展有针对性的预防措施提供重要的理论依据及实验基础。 方法： 一、幽门螺杆菌SlyD蛋白的原核表达、纯化及鉴定 根据GenBank中已报道的HPSH_05790的全基因组序列，用Primer5.0设计SlyD引物，并在引物中加入限制性酶切位点，以幽门螺杆菌胃癌来源菌株L301为模板，采用聚合酶链反应(PCR)扩增获得目的片段。将其进行T-A克隆至pGEM-T载体，转化大肠埃希氏菌(Escherichiacoli，E.coli) DH5a，双酶切鉴定筛选阳性克隆，进行序列测定;将测序结果提交GenBank，获得基因登录号，用序列比对分析SlyD基因的同源性;再将其定向插入pET-28a(+)载体，构建pET-28a(+)-S1yD表达载体，转化到表达宿主菌E.coliBL21，通过卡那霉素抗性筛选和双酶切鉴定阳性克隆;IPTG诱导其表达，并优化其表达条件（诱导时间和IPTG浓度），表达的SlyD蛋白用AKTAprimeTM plus层析系统进行自动纯化;纯化后的重组蛋白经PPIase检测其活性。 二、幽门螺杆菌SlyD对胃癌细胞生物学行为的影响 1、利用CCK-8以及western-blot检测PCNA、细胞免疫荧光检测KI-67等方法观察HpSlyD对胃癌细胞AGS增殖效应的影响。 2、通过软琼脂克隆形成实验观察HpSlyD对AGS细胞克隆形成能力的影响。 3、利用transwell以及western-blot和细胞免疫荧光检测MMP-9表达等方法观察HpSlyD对AGS细胞迁移效应的影响。 4、利用caspase-3活性检测以及western-blot检测caspase-3表达等方法观察HpSlyD对AGS细胞凋亡效应的影响。 三、幽门螺杆菌SlyD影响胃癌细胞增殖的机制 1、利用AGS和N87两种细胞系进一步证实HpSlyD对胃癌细胞的增殖作用。 2、利用Westernblot检测HpSlyD对p38、ERK、JNK以及转录因子NF-KB和IKB蛋白磷酸化表达水平的影响。 3、观察信号通路特异性抑制剂PD98059和SB203580对胃癌细胞增殖及信号传导通路中相关蛋白的影响。 4、利用TLR4抗体中和TLR4作用后，观察HpSlyD对p38及ERK信号传导通路的影响。 结果： 一、幽门螺杆菌SlyD蛋白的原核表达、纯化及鉴定 1.H.pyloriSlyD测序结果表明SlyD基因全长564bp，编码182个氨基酸，与GenBank中已知其他菌株基因序列的核苷酸同源性为97％。 2、成功构建了pET28a+-slyD原核表达质粒，DNA测序后与GeneBank公布的基因序列一致。 3、成功诱导表达并纯化了SlyD蛋白，经Western blot检测结果显示:该重组蛋白可与抗His标签抗体结合反应，经AKTAprimeTM plus层析系统进行自动纯化后可获得纯度约为97％，相对分子质量(Mr)约为34kDa的rSlyD，与预测结果一致，蛋白活性检测其具有PPIase活性。 二、幽门螺杆菌SlyD对胃癌细胞生物学行为的影响 1、不同浓度的幽门螺杆菌重组蛋白SlyD与AGS细胞作用24、48及72h后，细胞增殖的程度随着rSlyD浓度的增加和作用时间的延长而逐渐增加。 Western-blot及细胞免疫荧光结果亦显示，rSlyD可以使PCNA及KI-67的表达增强。 2、集落形成实验表明，rSlyD处理三周后的AGS细胞与对照组相比(P＜0.05)形成集落数最多。 3、transwell实验表明，100ng/ml rSlyD作用于AGS细胞48h后，发现其具有促进胃癌细胞迁移的能力(与对照组比较P＜0.05)。此外，Western-blot及细胞免疫荧光结果亦显示:rSlyD可以使MMP-9的表达增强。 4、caspase-3活性检测及western-blot检测caspase-3表达显示:100ng/mlrSlyD作用于AGS细胞48h后，具有抑制胃癌细胞凋亡的能力（与对照组比较 P＜0.05)。 三、幽门螺杆菌SlyD影响胃癌细胞增殖的机制 1、WesternBlot结果显示:HpSlyD可以上调p-p38及p-ERK蛋白表达的水平而对p-JNK蛋白表达水平无影响。 2、HpSlyD促进胃癌细胞增殖主要是通过激活P38及ERKI/2两条主要通路。抑制P38和MAPK/ERK通路可部分逆转HpSlyD促进胃癌细胞增殖的作用。提示激活P38和MAPK/ERK通路是HpSlyD促进肿瘤细胞增殖的机制之一。 3、WesternBlot结果显示:HpSlyD可以上调TLR4、p-NF-κB及p-ⅠκB蛋白表达水平。 4、HpSlyD可以引起TLR4表达上调，进而激活P38/p-ERK-IKB-NF-KB通路。 结论： 1、成功构建了HpSlyD基因的原核表达载体，获得了HpSlyD重组蛋白。 2.HpSlyD具有促进胃癌细胞增殖、迁移、转化，抑制胃癌细胞凋亡的能力。 3.HpSlyD通过上调TLR4表达进而激活P38/p-ERK-ⅠκB-NF-κB通路，从而促进胃癌细胞的增殖。