背景:脓毒症是由环境中生化因素导致的全身炎症反应综合征,也是全世界面临的重大公共卫生问题。当感染发生时,细菌内毒素（LPS）刺激巨噬细胞M1型极化,释放大量促炎因子,如不及时控制可导致脓毒症和死亡。不仅如此,M1型巨噬细胞还参与肥胖和糖尿病等多种疾病的发生发展。因此,M1型巨噬细胞促炎反应不仅是生命科学领域的重大问题,也是脓毒症等炎症疾病治疗的新靶点。线粒体是细胞内能量合成中心,可通过重塑自身的数量、形态和结构等稳态,参与调控细胞增殖和分化等重要生命过程。研究表明,线粒体可能是调控巨噬细胞炎症反应的重要信号平台,且感染和脓毒症条件下巨噬细胞线粒体出现异常。此外,M1型巨噬细胞释放大量ROS,是其杀灭病原菌的重要武器,而ROS可损伤线粒体,造成膜电位降低。预实验流式检测发现M1型巨噬细胞ROS和膜电位（Δψm）同时升高,但这与常理相悖。考虑到流式工作原理是以细胞为单位检测荧光信号,我们推测M1型巨噬细胞线粒体数目等稳态指标可能改变,进而导致上述矛盾现象。然而,M1型巨噬细胞线粒体稳态的变化规律及分子机制尚不清楚,有待深入研究。本课题期望阐明线粒体稳态参与巨噬细胞促炎调控的作用机制,为脓毒症等炎症疾病防治提供新策略。目的:1.分析巨噬细胞由静息态向M1型转化过程中线粒体稳态的变化规律。2.明确线粒体稳态重塑在M1型巨噬细胞促炎调控中的作用机制。3.探讨M1型巨噬细胞线粒体稳态重塑的分子调控机制。方法:1.LPS刺激RAW、THP-1、BV2、小鼠腹腔和骨髓原代巨噬细胞,构建M1型巨噬细胞模型。采用荧光染色、透射电镜和mt DNA拷贝等技术测定线粒体数量、形态、结构和膜电位,明确M1型巨噬细胞线粒体稳态的变化规律。2.通过相关性分析和构建线粒体缺失巨噬细胞RAW-ρ~0,探讨M1型巨噬细胞线粒体稳态重塑与促炎反应的联系。RNAseq分析静息态和M1型巨噬细胞的差异表达基因,寻找M1型巨噬细胞线粒体稳态重塑的关键调控因子。3.敲减或抑制Drp1,构建Drp1野生型载体(Drp1WT)、Drp1S616失活突变载体(Drp1S616A)和Drp1S616自发激活突变载体(Drp1S616E),体外研究Drp1调控M1型巨噬细胞线粒体稳态和促炎反应的作用机制。使用Drp1抑制剂Mdivi-1干预,体内研究Drp1对LPS诱导脓毒症小鼠腹腔巨噬细胞的调控功能。4.使用TLR4抑制剂TAK-242,研究LPS及其受体TLR4对Stat2表达和磷酸化的影响。通过敲减Stat2,并分别过表达Drp1WT和Drp1S616E,明确Stat2通过磷酸化Drp1调控M1型巨噬细胞线粒体稳态和促炎反应的作用机制。5.检测M1型巨噬细胞线粒体功能的变化,探讨线粒体稳态重塑与mt ROS生成之间的关系。敲减Stat2和Drp1,并使用mt ROS清除剂Mito Q,系统研究mt ROS在Stat2-Drp1调控M1型巨噬细胞促炎信号启动中的作用及机制。结果:1.LPS刺激巨噬细胞M1型极化,标志物CD11c表达升高,且促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β大量生成。M1型巨噬细胞FSC和SSC信号增强,表明细胞体积增大,且细胞器增多。多种细胞模型和技术手段证实,M1型巨噬细胞线粒体稳态显著改变,主要表现为数目增多、长度变短和嵴结构减少。而M1型巨噬细胞Δψm并非升高,而是降低,流式检测Δψm结果可能受线粒体数目影响。2.LPS刺激BMDMs后,细胞中线粒体数目和培养上清中促炎因子表达均随时间升高,且二者呈现正相关性。Et Br刺激构建mt DNA缺失的RAW-ρ~0细胞,与正常细胞相比,RAW-ρ~0中线粒体数目明显减少,且LPS诱导的促炎因子生成降低。可见,线粒体数量增多是启动巨噬细胞促炎反应的重要基础。分裂增强可导致线粒体数目增多和长度变短,与M1型巨噬细胞线粒体稳态变化相吻合,提示分裂融合异常可能是M1型巨噬细胞线粒体稳态重塑的关键机制。RNAseq筛选发现,Stat2和Drp1可能是M1型巨噬细胞线粒体稳态重塑的核心调控基因。3.Drp1是线粒体分裂的关键调控基因,我们发现LPS刺激巨噬细胞Drp1表达和S616磷酸化均显著增强,敲减或抑制Drp1可阻断LPS诱导线粒体分裂和稳态重塑,降低NFκB及下游促炎因子表达。敲减Drp1后分别过表达Drp1WT和Drp1S616A,发现Drp1S616失活突变可阻断LPS诱导线粒体稳态重塑和促炎反应;过表达自激活突变Drp1S616E,即使在无LPS刺激时也能增强巨噬细胞线粒体稳态重塑,进而启动促炎反应。此外,Drp1抑制剂Mdivi-1能有效阻断脓毒症小鼠腹腔巨噬细胞的促炎分化,改善动物炎症反应。上述结果提示,Drp1调控M1型巨噬细胞线粒体稳态重塑和促炎反应,而S616位点磷酸化是其发挥功能的关键。4.Stat2是细胞内重要的信号转导因子,RNAseq提示Stat2主要功能涉及调控线粒体、免疫反应、蛋白磷酸化和生物合成。LPS促进巨噬细胞Stat2和p-Stat2表达,LPS受体TLR4抑制剂TAK-242可阻断Stat2磷酸化。LPS处理早期可显著上调线粒体生物合成关键调控基因PGC-1α、Nrf1和TFAM表达,敲减Stat2抑制线粒体生物合成。此外,敲减Stat2能降低Drp1S616磷酸化,阻断线粒体重塑和促炎反应。敲减Stat2后分别过表达Drp1WT和Drp1S616E,发现Drp1WT组线粒体稳态重塑和促炎反应被抑制,而Drp1S616E组则显著升高。上述结果证实,Stat2通过磷酸化Drp1调控线粒体稳态重塑,进而启动巨噬细胞促炎反应。5.作为真核细胞关键的细胞器,线粒体的主要功能是合成ATP和产生ROS。我们发现M1型巨噬细胞中糖代谢发生重编程,氧化磷酸化代谢减弱,糖酵解代谢增强。LPS刺激下,巨噬细胞ATP水平降低,mt ROS含量升高,且mt ROS水平和线粒体数目之间呈现明显正相关,而线粒体缺失细胞的mt ROS生成能力则减弱。可见,M1型巨噬细胞线粒体稳态重塑后主要功能由合成ATP转变为生成ROS,是细胞内ROS的主要来源。进一步敲减Stat2和Drp1可阻断M1型巨噬细胞糖代谢重编程,促进ATP合成,降低ROS产生,表明Stat2-Drp1通过重塑线粒体稳态调控ROS生成。Mito Q是一种mt ROS特异性清除剂,可显著抑制LPS诱导NFκB磷酸化及核转位,降低TNF-α和IL-6的转录表达。上述结果表明,mt ROS在Stat2-Drp1调控M1型巨噬细胞促炎反应中发挥关键作用。结论:1.M1型巨噬细胞线粒体分裂增强,稳态重塑,表现为数目增多、长度变短和嵴结构减少。线粒体数目增多属于首次报道,是M1型巨噬细胞新的重要标志。2.M1型巨噬细胞线粒体稳态重塑导致糖代谢重编程,由线粒体途径的氧化磷酸化代谢转变为糖酵解代谢,线粒体的主要功能由合成ATP转变为产生ROS。3.线粒体稳态重塑是M1型巨噬细胞促炎启动的重要基础,Stat2-Drp1通过重塑线粒体稳态启动M1型巨噬细胞促炎反应,且ROS在其中发挥至关重要作用。4.首次发现Drp1通过重塑线粒体稳态调控M1型巨噬细胞促炎反应,而S616位点磷酸化是其发挥功能的关键,Drp1抑制剂Mdivi-1能够改善小鼠脓毒症。5.首次证实Stat2可通过磷酸化Drp1增强线粒体分裂,并上调线粒体生物合成,进而促使线粒体稳态发生重塑,Stat2是一个新发现的巨噬细胞促炎调控因子。