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研究背景与目的前列腺癌和乳腺癌分别是威胁男性和女性健康的最常见恶性肿瘤之一,具有很高的致死率。据美国癌症协会统计,仅2015年美国新增前列腺癌患者就达到220,800例,占当年新增男性癌症患者的26%。前列腺癌具有很高的致死率,其中四期前列腺癌患者的5年生存率仅为20%,10年生存率低于10%。尽管我国前列腺癌的发病率低于欧美国家,但是近年来也呈上升趋势,例如1998年到2008年间,我国前列腺癌发病率增加了212.5%,死亡率增加了124.9%。据据美国癌症协会统计,2015年美国新增乳腺癌患者约为231,840例,因乳腺癌死亡的患者约有40,290例。在我国乳腺癌的发病率也呈逐年上升的趋势,根据中国医学科学院的统计数据,2010年我国新增乳腺癌患者约20万例。前列腺癌和乳腺癌的发生是一个多基因共同参与的积累过程,然而疾病发生的分子机制尚未完全清晰。长链非编码RNA(Long non-coding RNA, lncRNA)是一类本身不编码蛋白、转录本长度超过200碱基的长链非编码RNA分子,在哺乳动物中lncRNA约占RNA总量的4%到9%。lncRNA在一系列细胞活动中发挥着重要作用,包括基因转录调控、介导染色质重建以及组蛋白修饰等。越来越多的研究表明：lncRNA的异常表达与包括前列腺癌和乳腺癌等疾病的发生相关。在前期研究中,研究者通过最新RNA测序技术和Real-Time PCR发现了一个在前列腺癌中出现频率较高的长链非编码RNA, PlncRNA-1。PlncRNA-1在前列腺癌的发生发展过程中起着重要的作用,其除了能够与雄激素受体(Androgen Receptor, AR)互相调节外,下调PlncRNA-1还会诱发肿瘤细胞的凋亡。作为在前列腺癌中首次发现的长链非编码RNA, PlncRNA-1在前列腺癌发生发展过程中的作用机制尚未完全阐明。前期研究发现：PlncRNA-1诱发的细胞凋亡过程中出现了Her-2的变化。由此推测,PlncRNA-1诱发细胞凋亡的机制可能是通过Her-2信号途径发挥作用的。在此背景下,本论文首先研究PlncRNA-1在前列腺癌发生中,是否通过Her-2途径诱发前列腺癌细胞凋亡,继而初探PlncRNA-1在乳腺癌发生中的作用机制,其最终研究成果有助于为前列腺癌和乳腺癌的防治提供新的理论依据和干预途径。研究方法在前列腺癌的研究中,本论文首先通过Real-Time PCR检测23例前列腺癌组织和癌旁正常组织标本中PlncRNA-1和Her-2的表达情况。然后,利用Real-Time PCR检测在LNCaP细胞中下调PlncRNA-1基因对Her-2基因表达的影响,以及在RWPE-1细胞中上调PlncRNA-1基因对Her-2基因表达的影响。本论文基于流式细胞检测的方法检验PlncRNA-1对细胞周期的影响,利用动物体内实验分析PlncRNA-1对前列腺癌细胞移植瘤生长的影响。最后,本论文基于Western blot探索PlncRNA-1对细胞周期蛋白CyclinD1表达的影响。在乳腺癌的研究中,本论文使用Real-Time PCR检测81例乳腺癌组织和癌旁正常组织标本中PlncRNA-1的表达情况,并且测量了不同乳腺癌细胞系中PlncRNA-1的表达情况。本论文用CCK8的方法检测]PlncRNA-1对乳腺癌细胞增殖能力的影响；利用Transwell的方法研究PlncRNA-1对乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响；利用动物内实验,研究PlncRNA-1对乳腺癌移植生长及肺转移的影响；利用Western bolt检测研究PlncRNA-1与乳腺癌细胞EMT相关蛋白的关系以及PlncRNA-1对PTEN/PI3K/AKT信号通路的影响。结果1. PlncRNA-1在前列腺癌中作用机制1.1在前列腺癌组织中PlncRNA-1和Her-2均为高表达本论文通过Real-Time PCR检测了23例前列腺癌组织和癌旁组织标本中PlncRNA-1和Her-2的表达。检测结果表明：PlncRNA-1和Her-2在前列腺癌组织中均为高表达。1.2 PlncRNA-1表达对Her-2表达的影响在LNCaP细胞中下调PlncRNA-1的表达可以促使Her-2表达的下调；在RWPE-1细胞中上调PlncRNA-1表达可以促使Her-2表达的上调。PlncRNA-1和Her-2表达之间存在高度的相关性。1.3 PlncRNA-1对细胞周期的影响在LNCaP细胞中下调PlncRNA-1能够促进CyclinD1表达的下降和G2/M期细胞比例明显增多；在RWPE-1细胞中上调PlncRNA-1能够造成CyclinD1表达的上升和G2/M期细胞比例明显减少。1.4 PlncRNA-1表达对前列腺癌细胞移植瘤生长的影响在动物实验中,PlncRNA-1下调后,前列腺癌细胞所形成移植瘤最终瘤体的重量也明显轻于对照组。同时移植瘤免疫组化检测和Western Blot检测的结果也证实PlncRNA-1下调后,Her-2和Cyclin-D1的表达要明显低于对照组。1.5 PlncRNA-1影响细胞周期的作用机制Her-2拮抗剂AC480可以阻断PlncRNA-1对前列腺细胞周期分布的影响。PlncRNA-1是通过调控Her-2的表达以影响前列腺细胞的周期分布。2. PlncRNA-1在乳腺癌中的表达及作用2.1 PlncRNA-1在乳腺癌组织及乳腺癌细胞系中的表达本论文首先采用定量Real-Time PCR的方法检测了81例乳腺癌肿瘤组织和癌旁组织标本中PlncRNA-1的表达情况。检测结果表明：PlncRNA-1在乳腺癌组织中的表达要高于其在癌旁组织中的表达。在侵袭性较强的T47D, SK-BR3, AU565, MDA-MB-231和MDA-MB-435s细胞中PlncRNA-1的表达显著高于在侵袭性弱的MCF10A, BT20,Hs578T, MDA-MB-468细胞中PlncRNA-1的表达。2.2 PlncRNA-1在乳腺癌组织及乳癌细胞增殖中的作用本论文首先利用shRNA下调MDA-MB-2311SK-BR3细胞中PlncRNA-1的表达,在PlncRNA-1基因下调后,MDA-MB-231和SK-BR3细胞的增殖速度明显减慢；其次上调Hs578T和MDA-MB-468细胞中PlncRNA-1的表达,在PlncRNA-1基因上调后,Hs578T和MDA-MB-468细胞的增殖速度明显加快。上述实验结果表明：PlncRNA-1在乳腺癌细胞中的表达能够促进细胞的增殖。2.3 PlncRNA-1的表达对乳腺癌细胞上皮间充质化相关蛋白的影响在MDA-MB-231和SK-BR3细胞系中,PlncRNA-1下调后, E-cadherin和α-catenin的表达明显增加,而N-cadherin和Vimentin的表达明显下降。而在Hs578T和MDA-MB-468细胞系中,PlncRNA-1上调后,E-cadherin和α-catenin的表达明显下降,而N-cadherin和Vimentin的表达上升。上述实验结果说明：PlncRNA-1的表达与乳腺癌细胞EMT密切相关。2.4 PlncRNA-1的表达对乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响本研究采用Transwell的方法对不同细胞系中PlncRNA-1基因修饰后细胞迁移和侵袭能力的变化进行检测。在MDA-MB-231和SK-BR3细胞系中,PlncRNA-1下调后,迁移和侵袭细胞的数量明显减少。而在Hs578T和MDA-MB-468细胞系中,PlncRNA-1上调后,迁移和侵袭细胞的数量明显增加。上述实验结果表明：PlncRNA-1的表达可以增强乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力。2.5 PlncRNA-1的表达对乳腺癌移植瘤生长的影响本部分研究PlncRNA-1上调或下调对乳腺癌移植瘤生长的影响。在研究中,将各组乳腺癌细胞株种植于裸鼠皮下,6周后处死裸鼠,取出移植瘤,称重并记录,绘制生长曲线。在MDA-MB-231细胞系中,PlncRNA-1下调后,最终成瘤的大小减小,移植瘤的生长速度也明显下降。与之相反,在Hs578T细胞系中,PlncRNA-1上调后,最终成瘤的大小明显增加,移植瘤的生长速度也明显上升。上述实验结果说明：PlncRNA-1的表达可以促进乳腺癌肿瘤的生长。2.6 PlncRNA-1的表达对乳腺癌肺转移的影响本研究将各组乳腺癌细胞株种植于裸鼠皮下,6周后处死裸鼠,取出裸鼠的肺脏,切片观察转移灶的情况。在MDA-MB-231细胞系中,PlncRNA-1下调后,肺转移灶明显减少。而在Hs578T细胞系中,PlncRNA-1上调后,肺转移灶显著增多。上述实验结果表明：PlncRNA-1的表达可以促进乳腺癌肺发生转移。2.7 PlncRNA-1与PTEN/Pl3K/AKT;通路的关系本研究利用基因芯片检测PlncRNA-1高表达后,Hs578T细胞系中其他基因的变化情况。实验分析结果显示：PlncRNA-1高表达后,PTEN/PI3K/AKT信号通路发生了明显的变化。本研究对MDA-MB-231细胞系中PlncRNA-1下调后以及Hs578T细胞系中PlncRNA-1上调后,PTEN/PI3K/AKT通路涉及的一系列蛋白进行分析。分析结果表明：在MDA-MB-231细胞系中下调PlncRNA-1后,PTEN表达增强,PI3K及AKT的表达水平无明显变化,p-PI3K及p-AKT表达均下调,PI3K/AKT信号通路活性下降。在Hs578T细胞系中,上调PlncRNA-1后,PTEN的表达下降,PI3K及AKT的表达水平无明显变化,p-PI3K及p-AKT表达均上调,PI3K/AKT信号通路活性上升。为了进一步研究PlncRNA-1是否是通过作用于PTEN来影响乳腺癌细胞的增殖和迁移,本研究下调了MDA-MB-231-ShPlncRNA-1细胞中PTEN的表达。PTEN下调后,p-PI3K及p-AKT的表达、细胞增殖能力、细胞侵袭能力和迁移能力均恢复到PlncRNA-1下调前的水平。由此可见,PlncRNA-1通过对PTEN的负调控来增加乳腺癌细胞的增殖,迁移及侵袭能力。结论1. PlncRNA-1是前列腺癌中一致癌基因,本论文通过开展体外细胞实验及动物体内实验发现：PlncRNA-1能够调节细胞周期及细胞周期蛋白Cyclin-D1的变化；PlncRNA-1通过Her-2途径调控前列腺癌细胞的增殖与凋亡。2. PlncRNA-1在乳腺癌的发生发展过程中同样发挥着致癌基因的作用,本论文通过研究发现：PlncRNA-1可以促进乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭以及乳腺癌移植瘤的生长和肺转移。PlncRNA-1在乳腺癌发生发展中的上述作用与PlncRNA-1促进乳腺癌细胞的EMT以及激活PTEN/PI3K/AKT通路有关。