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胃癌(Gastric carcinoma,GC)是近40年来最常见的消化道恶性肿瘤之一。胃癌组织中新生血管的形成与存在为胃癌细胞成长提供物质基础。因此,明确胃癌中血管形成的机制,对我们寻找胃癌治疗靶点具有重要价值。信号蛋白(Semaphorins,Semas)是一大家族的分泌和膜结合分子,最初研究涉及神经系统的发展和轴突引导。最近,研究发现它们可以调节细胞粘附、细胞运动、血管生成、免疫反应和肿瘤进展,但其对肿瘤进展和胃癌血管生成的的具体机制尚未充分阐明。众所周知,血管生成是一个由多基因参与的复杂生物学过程,参与肿瘤的发生和发展。研究表明,微小核糖核酸(Micro ribonucleic acids,mi RNAs)是血管生成的重要调节因子,在肿瘤组织血管生成的调控中具有重要意义。在本研究中,我们应用Targetscan数据库预测到mi R-30b与Sema3A具有结合位点,且双素荧光素酶报告实验检测到mi R-30b可以靶向结合Sema3A的3’非翻译区(3’Untranslated region,3’UTR),提示mi R-30b与Sema3A的互靶性。接下来我们发现将mi R-30b模拟物转染到MKN28细胞中后,可以显著下调Sema3A m RNA和蛋白的表达,结果提示mi R-30b可能是通过直接降解胃癌细胞中sema3A的m RNA表达水平,从而达到靶向调控sema3A的目的。本研究中收集阴性对照组(NC组)、mi R-30b模拟物组(mi R-30b Mimics组)、mi R-30b抑制剂组(mi R-30b Inhibitor组)、mi R-30b抑制剂+sema3A小干扰RNA组(mi R-30b Inhibitor+si RNA组)和sema3A组的胃癌细胞培养基,应用于人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)中。我们发现mi R-30b Inhibitor组和sema3A组血管形成被抑制。sema3A在mi R-30b模拟物组和mi R-30b抑制剂+sema3A si RNA组中表达降低,但这两实验组中血管形成情况被促进;p-VEGFR2在mi R-30b模拟物组蛋白表达水平升高,而在mi R-30b抑制剂组表达降低。mi R-30b模拟物组促进的血管形成和p-VEGFR2被VEGFR2抑制剂SKLB1002阻断。这些结果表明mi R-30b可能通过靶向调节sema3A在胃癌细胞形成的微环境中调控血管生成。本研究对未来开发治疗胃癌的分子靶向药物具有重要的理论和实际指导意义。目的:在以MKN28为代表的胃癌细胞系中,通过外源性增加mi R-30b下调幅度,检测mi R-30b是否以直接降解或翻译抑制的方式抑制sema3A的表达及两者对血管生成的影响,并更深入探究其调控肿瘤血管生成的生物学分子机制。方法:1.利用Target Scan数据库和双素荧光素酶报告实验(The Dual-Glo Luciferase Reporter Assay)从碱基互补配对原则上进行靶基因预测,验证mi R-30b与sema3A互靶性。2.利用质粒转染技术将不同浓度mi R-30b模拟物和抑制剂转染至培养好的MKN28胃癌细胞系中,利用实时逆转录定量聚合酶链反应(RTq PCR)技术检测细胞转染后mi R-30b m RNA的表达情况,并找出mi R-30b转染最佳浓度,采用此最佳浓度用于后续实验,并且利用质粒转染技术干扰MKN28胃癌细胞系中sema3A的表达,以便于更好的探讨人胃癌细胞自身发展中mi R-30b所产生的其他生物学功能。3.利用实时逆转录定量聚合酶链反应(RT-q PCR)技术检测细胞转染mi R-30b模拟物及阴性对照物之后,观察这两组中sema3A在MKN28胃癌细胞系中的m RNA表达情况;并且利用蛋白质免疫印迹技术(Western Blotting)检测这两组中sema3A在MKN28胃癌细胞系中的蛋白表达水平。4.利用质粒转染技术将阴性对照物、mi R-30b模拟物、mi R-30b抑制剂转染至培养的MKN28胃癌细胞系中,并对胃癌细胞中的sema3A进行干扰沉默,在胃癌细胞MKN28中共转染sema3A的干扰RNA和mi R-30b抑制物,随后利用蛋白质免疫印迹技术(Western Blotting)检测sema3A在MKN28细胞中的蛋白表达水平。5.收集上述阴性对照组(NC组)、mi R-30b模拟物组(mi R-30b Mimics组)、mi R-30b抑制剂组(mi R-30b Inhibitor组)、mi R-30b抑制剂+sema3A si RNA组(mi R-30b Inhibitor+si RNA组)以及外源性加入sema3A组的胃癌细胞培养基,应用于人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中,利用小管形成试验(Tube formation assay)检测观察上述各组HUVECs中小管形成情况。6.收集阴性对照组(NC组)、mi R-30b模拟物组(mi R-30b Mimics组)、mi R-30b抑制剂组(mi R-30b Inhibitor组)的胃癌细胞培养基,应用于人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中,利用蛋白质免疫印迹技术(Western Blotting)检测VEGFR和p-VEGFR在HUVECs中的表达情况。7.在mi R-30b模拟组中外源性加入p-VEGFR的抑制剂SKLB1002后,首先利用蛋白质免疫印迹技术(Western Blotting)检测p-VEGFR2和VEGFR2的蛋白表达情况,随后利用小管形成试验(Tube formation assay)检测这两组(mi R-30b Mimics组、mi R-30b Mimics+SKLB1002组)HUVECs中小管形成情况。结果:1.从Target Scan数据库可以得到mi R-30b与sema3A m RNA 3’UTR突变位点的结合位点;双素荧光素酶报告结果显示,WT+Mimics组相对荧光素酶活性较WT+NC、Mut+NC和Mut+Mimics组明显降低(P<0.05)。2.mi R-30b和sema3A在胃癌细胞中m RNA的表达情况。实时逆转录定量PCR结果显示,细胞转染后各浓度(0n M、1n M、10n M、100n M)的mi R-30b模拟物和抑制剂均可分别上调(P<0.05)和下调(P<0.05)mi R-30b的表达,具有浓度依赖性。并且在MKN28胃癌细胞系中对mi R-30b模拟组和阴性对照组进行RT-PCR检测,结果显示,与阴性对照(NC)组相比较,mi R-30b模拟物可以明显降低胃癌细胞中sema3A m RNA的表达(P<0.05)。3.各组(NC组、mi R-30b Mimics组、mi R-30b Inhibitor组、mi R-30b Inhibitor+si RNA组和sema3A组)对HUVECs成管能力的比较。体外小管形成试验结果显示,与NC组相比,mi R-30b Mimics组和mi R-30b Inhibitor+si RNA组中HUVECs小管形成数量明显增多,有明显的管腔结构(P<0.05),与NC组相比,mi R-30b Inhibitor组小管数量明显减少,没有明显的管腔结构(P<0.05)。4.sema3A在胃癌细胞中的蛋白表达情况。蛋白质免疫印迹结果显示,在四个实验组中,与NC组相比,mi R-30b模拟组中sema3A在MKN28胃癌细胞系中表达水平明显降低(P<0.05),mi R-30b抑制组中sema3A的表达水平明显增高(P<0.05)。并且在mi R-30b抑制组中外源性加入sema3A si RNA后,sema3A的表达水平较抑制组下降明显(P<0.05)。5.p-VEGFR2和VEGFR2的蛋白表达在HUVECs中蛋白表达情况(mi R-30b Mimics组和mi R-30b Inhibitor组)。蛋白质免疫印迹结果显示,与阴性对照组相比,mi R-30b模拟物组的HUVECs中p-VEGFR2的蛋白表达显著上调(P<0.05),而mi R-30b抑制组中p-VEGFR2的蛋白表达则显著下调(P<0.05);但与NC组相比,两个实验组的HUVECs中VEGFR2的蛋白表达无明显统计学差异(P=0.8199)。6.p-VEGFR2和VEGFR2的蛋白表达在HUVECs中蛋白表达情况(Mimics组和Mimics+SKLB1002组)。在mi R-30b模拟组中外源性加入p-VEGFR的抑制剂SKLB1002,蛋白免疫印迹结果显示,与mi R-30b Mimics组相比,Mimics+SKL1002组pVEGFR2表达水平明显受到抑制(P<0.05),而HUVECs中VEGFR2的表达无显著差异(P=0.5850)。7.外源性加入p-VEGFR的抑制剂SKLB1002后,观察各组HUVECs中小管形成情况。体外小管形成试验结果显示,加入抑制剂后HUVECs形成的小管数量较mi R-30b模拟组明显减少,并且管腔结构的完整性也明显降低(P<0.05),血管生成能力受到明显抑制。结论:1.在胃癌细胞MKN28中,mi R-30b可能通过直接降解m RNA的方式靶向调控sema3A的表达;2.Sema3A可能是mi R-30b在MKN28细胞中调控血管生成的关键靶基因;3.在胃癌细胞MKN28中,mi R-30b可能通过Sema3A/p-VEGFR2轴调控肿瘤血管生成。