本课题对肝纤维化“瘀血阻络”病机理论进行了探讨,并对芪术颗粒“化瘀通络”作用影响肝窦毛细血管化的机制进行了研究。1理论研究部分通过对中医学及现代医学肝纤维化相关文献的整理分析,在课题组多年深入研究的基础之上,对肝纤维化现代医学研究概况、中医学络病理论在肝纤维化防治中的应用及“化瘀通络”在肝纤维化防治中的作用等方面进行了初步的探讨。依据络病理论,肝纤维化的病位主要在肝络,是由湿热疫毒、情志郁结等诸多病因长时间作用于肝脏及相关脏腑所导致的一种疾病。其病机主要是肝络气血运行的异常,酿痰生瘀阻于肝络,致使其渗灌濡养肝体、疏通畅达气血功能失常,“瘀血阻络”是肝纤维化发生发展过程中的一个重要病机。所以在治疗上,应当以“化瘀通络”为一个治疗重点,结合病人整体情况,辨证施治。结合现代医学对肝纤维化的研究进展,发现肝窦毛细血管化作为影响正常肝细胞和肝窦血液间的物质交换的重要因素,在肝纤维化的发生及逆转治疗中起着重要的作用,而肝窦毛细血管化又可归属于肝纤维化“瘀血阻络”概念范畴,其可能是肝纤维化“瘀血阻络”病机的重要内容之一2实验研究部分目的：观察芪术颗粒对四氯化碳所致肝纤维化形成阶段大鼠模型肝窦毛细血管化的干预作用,阐释芪术颗粒“化瘀通络”作用防治肝窦毛细血管化及肝纤维化的作用机制。方法：采用四氯化碳腹腔注射法复制肝纤维化形成阶段模型大鼠,同时予芪术颗粒灌胃预防,并设立空白对照及模型对照组。分别于造模的第4及第8周取大鼠肝脏组织,切取肝脏标本约1mm3,迅速置入4℃2.5%戊二醛固定,经锇酸、环氧树脂及醋酸铀-柠檬酸铅等固定、包埋、切片染色后,使用JEOL JEM-1400型透射电子显微镜观察肝细胞、肝窦壁超微结构及肝窦毛细血管化改变。同时,取左外叶约2cm×1.5cm×0.5cm大小肝组织于10%甲醛溶液固定,行层粘连蛋白(LN)及Ⅳ型胶原(Co-Ⅳ)免疫组化染色制片,奥林巴斯IX70荧光倒置显微镜观察切片黄染的深浅与面积,测定每张切片黄染部分的累积光密度值(IOD),定量分析LN、Co-Ⅳ的在大鼠肝脏中的沉积情况。另外,取约200mg新鲜肝组织于-80℃液氮中保存,行实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测各组大鼠肝脏血管内皮生长因子(VEGF)mRNA的表达水平。结果：1电镜观察结果空白对照组大鼠肝细胞多为单核多角形,细胞核圆且多位于细胞中央。可见多种细胞器,数个细长粗面内质网囊管聚在一起,平行排列。线粒体呈圆形或卵圆形,基质深暗,数量多,遍布细胞各处,嵴的数量中等。肝细胞内常可见糖原粒和脂滴。内皮细胞有窗孔,Disse间隙间可见由肝细胞向间隙内凸起的微绒毛。模型对照组可见大量肝细胞凋亡,线粒体水肿,细胞器溶解,细胞呈空泡样变,相邻肝细胞间边界不清、细胞连接消失。细胞胞核深染,胞质浓缩,细胞内糖原颗粒消失。毛细胆管腔扩张,其内微绒毛消失。形成毛细胆管的相邻肝细胞的质膜连接处的紧密连接结构消失,胆汁渗入肝细胞胞浆内。并且随着造模时间的延长,以上改变呈现出日益加重的情况。同时随着造模时间的增长,肝窦内皮细胞窗孔消失,内皮细胞下形成连续基膜,肝窦管腔扩张,Disse间隙变窄,细胞质混沌不清。芪术颗粒组可见肝细胞再生活跃,内质网数量增加,细胞器溶解消失,细胞间连接重现。8周组大鼠肝脏细胞较4周组细胞损伤严重,但其内质网数量较4周组为多。4周及8周组大鼠毛细胆管内微绒毛重现,肝窦内皮细胞窗孔重现。Disse间隙有所恢复,但内皮细胞下基膜仍存在。总体来看,以上改变4周组较8周组大鼠为轻。2芪术颗粒对Ⅳ型胶原及层粘连蛋白的影响空白对照组LN在大鼠肝组织汇管区血管壁有少量分布,Co-Ⅳ则少量分布于静脉、汇管区等部位,二者着色均为棕黄色。模型对照组及芪术颗粒组大鼠肝组织LN、Co-ⅣIOD值均较空白组有显著增加(13.89±1.70vs1.61±0.65,15.92±1.96vs1.43±0.59；12.24±1.80vs1.33±0.56,17.82±2.94vs1.48±0.33,P<0.01),且模型对照组大鼠肝组织LN、Co-Ⅳ表达IOD值随着实验时间的延长亦显著增加(13.89±1.70vs15.92±1.96；12.24±1.80vs17.82±2.94,P<0.01)。芪术颗粒组大鼠肝组织LN、Co-ⅣIOD值较模型组显著为低(8.15±2.01vs13.89±1.70,9.64±1.97vs15.92±1.96；7.32±2.11vs12.24±51.80,11.49±3.31vs17.82±2.94,P<0.01),且随实验时间延长,芪术颗粒组大鼠肝组织LN及Co-ⅣIOD值增长幅度均要较模型对照组为低(9.64±1.97vs8.15±2.01,11.49±3.31vs7.32±2.11)。3芪术颗粒对VEGF mRNA表达的影响模型对照组大鼠肝脏VEGF mRNA表达量在第4、8周两个时间点较空白组均存在显著的差异(0.33±0.02vs0.01±0.01,0.61±0.44vs0.03±0.03,P<0.01)。芪术颗粒组大鼠肝组织VEGF mRNA表达量与模型对照组相比在第4周存在明显降低(0.25±0.06vs0.33±0.02,P<0.05),第8周虽较模型对照组为低但未见显著性差异(0.59±0.35vs0.61±0.44)。结论：1、芪术颗粒可以减轻四氯化碳对肝细胞的损伤作用,保护肝细胞结构的完整,促进肝细胞修复,减轻内皮下连续基底膜的形成及内皮细胞失窗孔的严重程度。2、芪术颗粒可以减少层粘连蛋白及Ⅳ型胶原的沉积,减轻肝窦内皮下连续基底膜形成,从而减轻肝纤维化的严重程度。3、芪术颗粒可调控VEGF mRNA的表达,进而影响肝窦毛细血管化的形成。4、芪术颗粒对VEGF mRNA表达的调控及对Ⅳ型胶原及层粘连蛋白沉积的干预,可能是其“化瘀通络”作用治疗肝窦毛细血管化及肝纤维化的重要机制。