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在成熟肝脏的Herring狭隙存在一种具有双向分化潜能的细胞，在严重肝损伤或肝细胞的再生受到抑制时，能够分化为肝实质细胞和胆管上皮细胞, 称为肝干细胞。对肝损伤修复具有重要的意义 。肝细胞生长因子（HGF）是一种具有广泛生物功能的细胞因子，能够促进肝细胞等多种细胞的生长增殖，诱导细胞的离散。在内皮细胞和肿瘤细胞，HGF能够保护细胞免受毒性物质、射线及炎性因子等引起的细胞凋亡，还能够拮抗Fas及胆酸诱导的肝细胞凋亡。在肝干细胞的增殖、分化及凋亡过程中, HGF也起着重要的调控作用。然而，HGF如何参与肝干细胞的调控及其信号传导机制尚不十分清楚。NF-κB是一种调节免疫、炎症及生长反应等多种基因的重要调控因子，在细胞的生存和凋亡调控中起着极其关键的作用。通常NF-κB处于无活性状态，当受到外界各种刺激时，与其结合的抑制蛋白IκBa首先发生磷酸化及降解。游离的NF-κB发生核转移并激活靶基因的转录。在多种细胞，抑制NF- κB能够导致细胞的凋亡，而NF- κB活化可以使细胞生存。在肝细胞, NF- κB在抑制TNF介导的凋亡中起重要作用。有报道，细胞因子能够通过激活NF- κB途径而刺激细胞的生存，细胞因子与NF- κB可能有着密切的功能性联系。NF- κB是否在肝干细胞的增殖及凋亡调控中亦起着关键作用，我们将对此进行研究探讨。此外，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)途径被认为在细胞生存及抗凋亡信号转导中起重要作用。PI3K和MAPK途径是否也参与肝干细胞的增殖、分化及凋亡的调控？这些信号途径与NF- κB之间存在怎样的联系?为此我们用大鼠来源的肝干细胞WB F-344 作为模型，研究细胞因子在体外对肝干细胞生长、分化及凋亡的调控； HGF对WB F-344细胞的抗凋亡作用及离散效应；NF- κB 在HGF介导的信号转导中的作用与<WP=16>调控；ERK1/2、p38-MAPK、PI3K/AK等信号途径在HGF介导的信号转导中的作用；以及这些信号转导途径之间的相互联系和作用机制。方 法 1． 检测细胞因子对肝干细胞的调控作用 WB F-344细胞用不同浓度的细胞因子HGF、EGF、FGF、胰岛素、IL－6、TNF-α作用，24小时后，通过H3TDR掺入法检测细胞因子对肝干细胞增殖的影响；提取WB F-344细胞蛋白，用Western blot方法检测WB F-344细胞表面细胞因子受体HGF受体（c-met）、EGF受体、FGF-α受体和TGF-?等受体蛋白的表达； 2． WB F-344细胞体外诱导分化 WB F-344 细胞以5×103/孔接种于6孔培养板，8h后换分化培养体系：高糖DMEM、10％胎牛血清、HGF 10ng～50ng/ml、EGF 20ng/ml、Isulin 1ug/ml、地塞米松（Dex） 1(M。1－5天HGF用50ng/ml，以后改为10ng/ml维持，每3天半量换液一次，连续培养。在不同时间收集分化培养的细胞，提取RNA, 逆转录PCR检测细胞表面标志。PCR条件：94℃ 1min 58℃ 1min 72℃ 1min,35循环。ALB上游引物 ：5′ AAG GCA CCC CGA TTA CTC CG 3′下游引物：3′TGC GAA GTC ACC CAT CAC CG 5′，AFP 上游引物：5′CAG TGA GGA GAA ACG GTC CG 3′下游引物：3′ATG GTC TGT AGG GCT CGG CC 5′。3． HGF的抗凋亡作用及离散作用 为检测HGF对凋亡的保护作用。WB F-344细胞用ActD (300nmol)预处理 30 min,然后用TNF-α（100ng/ml）诱导凋亡，同时加入或不加入不同浓度的HGF (0,10,20,40,80ng/ml)。24小时后，提取细胞DNA或收集细胞，通过DNA电泳或流式细胞仪（FACS）检测细胞凋亡。进一步，WB F-344细胞用HGF(40ng/ml)作用24hr后，用PBS洗涤，95%乙醇固定，用溶于20%乙醇的终浓度为0.2%的结晶紫染色,风干镜检，照相，检测HGF的离散效应。4． HGF 刺激ERK, p38MAPK, PI3K/Akt信号转导途径的激活 WB F-344 细胞在含0.5% 血清的培养液中饥饿 12h, 然后用 HGF (40ng/ml)刺激不同时间（0、5、15、30、60、120min），通过western blotting 检测 ERK, p38MAPK, Akt等信号分子及其磷酸化蛋白(P-ERK,P-p38MAPK, P-Akt)的表达。HGF激活NF-κB结合活性和转录活性 （A）我们首先检测HGF对NF-κB DNA结合活性的调节。 WB F-344细胞 用 HGF (40ng/ml)刺激不同时间（0，15，30，60，120Min），然后提取核蛋白，P32标记NF-κB<WP=17>5． 寡核苷酸探针，通过EMSA方法检测NF-κB的DNA结合活性。 （B）进一步检测HGF促进NF-κB 的转录活性，我们用 NF-κB 报告基因质粒(BD Great EscA PeTM SEAP vector)瞬时转染WB F-344细胞，这种质粒包含一个与NF-κB结合位点相连的SEPA荧光报告基因，转染细胞然后用不同浓度的HGF（0，10，20，40ng/ml）刺激 8小时, 通过BD Great EscA PeTM SEAP荧光检测系统检测NF-κB的转录活性。（C）检测 I(B(磷酸化和降解 用 HGF (40ng/ml)作用WB F-344细胞，在不同时间（0，15，30，60，120Min）提取蛋白，通过western blotting检测 I(B(。6． NF-κB激活在HGF介导的抗凋亡效应中的作用 （A）首先用NF-κB的特异抑制剂 BAY 11-7082 和 ASA阻断NF-κB途径，然后在HGF存在下用ActD/TNF-α诱导细胞凋亡, 通流式细胞仪检测细胞凋亡。（B）用不同的抑制剂分别阻断ERK1/2、p38-MAPK、PI3K/AKT等信号途径，然后通过流式细胞仪检测HGF对TN