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磷酸肌醇是调节囊泡转运的重要信号分子,其代谢水平的紊乱与GLUT4囊泡转运障碍及2型糖尿病的发生息息相关。在脂肪细胞中,已有研究表明,磷脂酰肌-4,5-二磷酸[PI(4,5)P2]参与了胰岛素刺激下的GLUT4囊泡的转运调控。然而,由于之前的研究多采用普通的生化及蛋白敲减的方式,作用时间长,也缺乏对磷酸肌醇信号参与调控GLUT4囊泡转运的时空机理的探索。本论文研究中建立了一系列可实现单细胞及亚细胞水平的PI(4,5)P2代谢快速调控的光控蛋白元件,结合活细胞全内反射荧光显微成像技术(TIRFM),借由对3T3-L1脂肪细胞中GLUT4囊泡转运各步骤的实时高分辨成像,深入分析了 PI(4,5)P2参与GLUT4转运的时空调节机制。本论文研究的主要内容和成果总结如下:1、单细胞中磷酸肌醇代谢瞬时调控方法的建立在优化3T3-L1前脂肪细胞诱导分化及高效率转染的前提下,基于CIBN/CRY2光遗传学元件,建立了能瞬时定位至细胞膜、线粒体、高尔基体与GLUT4囊泡多个胞内位点的光控蛋白元件,并结合活细胞显微成像,验证了这些光控蛋白的有效性。2、胞内PI(4,5)P2代谢水平瞬时调控对GLUT4囊泡转运的作用研究应用4’去磷酸化酶Sac1与5’去磷酸化酶OCRL的光控元件,瞬时降低细胞膜上PI(4,5)P2的含量以探究其对GLUT4转运全过程的影响。实验结果表明,细胞膜是一个重要的调控位点,细胞膜上PI(4,5)P2含量的降低会抑制GLUT4的转运以及囊泡的融合过程。3、亚细胞水平的PI(4,5)P2代谢调控对GLUT4转运的影响建立对单个GLUT4囊泡上PI(4,5)P2代谢水平的瞬时光调控方法,发现基础状态下锚定位点PI(4,5)P2的降低会促使囊泡解锚定的发生。同时,解锚定现象的发生对胰岛素刺激下的Akt的磷酸化水平不会产生影响,但是会显著抑制胰岛素刺激下的GLUT4囊泡的锚定和融合。实验结果表明,PI(4,5)P2在GLUT4囊泡胞吐过程中发挥的重要作用。4、亚细胞水平的PI(3,4,5)P3代谢调控对GLUT4转运的影响应用PI(3,4,5)P3中p110α的结合体iSH2,建立上调单个GLUT4囊泡中PI(3,4,5)P3含量的瞬时光调控方法。实验发现基础状态下该位点的调控既不会影响细胞膜上PIP3的总含量,也不会影响锚定过程及Akt的磷酸化水平,但显著上调了基础状态下的GLUT4转运与融合。实验结果表明,在囊泡锚定过程中,PI(4,5)P2或许是磷酸化为PIP3从而促进后续GLUT4囊泡的融合及转运过程。本论文深入探究了 PI(4,5)P2对脂肪细胞中GLUT4囊泡转运的调控机制,研究发现细胞膜上的PI(4,5)P2对胰岛素信号的转导以及胰岛素刺激下的GLUT4囊泡的转运过程至关重要。此外,本论文的研究表明细胞膜上的PI(4,5)P2也许发挥双重作用,其作为PIP3合成的前体参与调控胰岛素信号通路的激活与传递,还可直接参与GLUT4囊泡锚定过程的调节,影响GLUT4蛋白的膜转运。这些研究成果加深了磷酸肌醇PI(4,5)P2对GLUT4转运调控机制的了解,为未来应用光遗传学工具开展类似的研究提供了新的思路。