糖尿病肾病(diabetic kidney disease, DKD)是糖尿病最主要微血管并发症,患者一旦出现大量蛋白尿,肾功能将进行性下降。由于其发病机制复杂,目前的治疗措施疗效有限。中医药治疗在控制DKD方面具有一定优势。前期研究结果显示,导师经验方糖肾方可减少2型DKD患者尿蛋白排泄、提高估算的肾小球滤过率,升高血浆谷胱甘肽水平,具有一定的保护肾功能及抗氧化作用。普遍认为,氧化应激在DKD发生发展中起到重要作用,活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)可激活多条信号通路,引起内皮细胞、系膜细胞、足细胞、肾小管间质损伤,从而加重DKD。近年来,主要表达于肾小管上皮细胞的肌醇加氧酶(myo-inositol oxygenase, MIOX)在DKD发生发展中的作用逐渐被发现,认为其参与调控细胞内ROS生成,与氧化应激密切相关,可能成为DKD干预新靶点。为了进一步观察、验证糖肾方干预2型DKD的长期疗效,探索其可能机制,本研究选用自发性2型DKD小鼠动物模型,观察糖肾方对小鼠的干预作用。在此基础上,体外实验验证MIOX与氧化应激的关系。此外,课题组开展了糖肾方治疗DKD有效性和安全性的随机、双盲、安慰剂平行对照、多中心临床试验,将氧化应激指标纳为次要疗效指标,以期为糖肾方保护DKD的抗氧化作用提供更全面证据。目的：1.研究糖肾方对白发性2型糖尿病db/db小鼠肾脏损伤的保护作用,探索其机制是否与抗氧化应激、降低MIOX表达有关。2.探索MIOX在高糖培养的大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK52E)中的表达变化及其在近端肾小管上皮细胞氧化应激中的作用。3. 由于糖肾方治疗DKD有效性和安全性的随机、双盲、安慰剂平行对照、多中心临床试验尚未揭盲,本研究归纳试验实施过程中影响质量控制的关键环节,为提高研究质量提供帮助。方法：1.糖肾方对db/db小鼠肾脏保护作用及机制研究采用8周龄自发性2型糖尿病模型db/db小鼠,随机分为模型组(db/db组)、糖肾方治疗组(db/db+TSF组),同周龄不发病db/m小鼠作为正常对照组(db/m组),db/db+TSF组小鼠采用糖肾方(2.4g/kg-d)连续灌胃给药12周,db/m组和db/db组小鼠给予等量蒸馏水。所有小鼠均以常规普通饲料顺应性喂养2周后,开始干预。每日观察小鼠一般状态,每周测量体重,每4周检测血糖、24h尿白蛋白。实验第12周进行动物取材,小鼠禁食12h后眼内眦取血,全自动生化仪检测肝、肾功能和血脂。之后迅速打开腹腔,摘取双侧肾脏并称重,一部分肾组织用于组织病理分析,另一部分分离出肾皮质用于分子生物学检测。肾组织进行PAS染色观察病理损伤,计算肾小球系膜基质百分比,TBA法检测血清、尿液中丙二醛含量,Wester blot.实时荧光定量PCR、免疫组化方法检测小鼠肾组织中氧化应激相关的NADPH氧化酶亚基、Nrf2通路、MIOX及足细胞标志物表达。2. MIOX在高糖诱导肾小管上皮细胞氧化应激中的作用采用5.5、10、20、30 mM浓度葡萄糖刺激大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK52E) 48h,30 mM葡萄糖刺激NRK52E细胞12.24.36.48.60h。 Western blot方法检测细胞内MIOX、Nox4、 Nrf2表达变化,分别绘制葡萄糖对NRK52E氧化应激损伤的剂量和时间依赖曲线,确定最佳刺激剂量和时间。设计MIOX基因siRNA Oligo干扰序列,筛选出敲降效率最高者转染至NRK52E细胞,6h后更换终浓度5.5、30mM葡萄糖培养基,48h后收集细胞,DCFH-DA探针检测细胞内ROS水平,Western blot检测细胞内MIOX、Nox4、Nrf2、 NQO1蛋白表达。3. 归纳总结糖肾方治疗DKD有效性和安全性的随机、双盲、安慰剂平行对照、多中心临床试验实施过程中的质量控制要点。结果：1.糖肾方可改善自发性2型糖尿病模型db/db小鼠肾组织损伤,其机制与降脂、抗氧化应激、保护足细胞有关(1)肾脏保护作用：给药0至12周,db/db组体重明显高于db/m组(P<0.001),db/db+TSF组在第6周(小鼠16周龄)出现体重下降,并持续至实验结束(P<0.05)。糖肾方干预可降低db/db组升高的肾重(P<0.01)。实验期间,db/m组血糖保持稳定,db/db和db/db+TSF组血糖均高于db/m组(P<0.01),但两组之间无差异。与db/m组比,db/db组血清AST、ALT升高(P<0.01,P<0.001),糖肾方干预可有效改善其异常的肝功能(P<0.05,P<0.05)。db/db组血清TC、FFA、LDL-C较db/m组显著升高(P<0.001,P<0.05,P<0.001),糖肾方可改善db/db小鼠血脂紊乱(P<0.001,P<0.05,P<0.001)。实验过程中,db/db组24h尿白蛋白较db/m组升高(P<0.001),给药第8周开始,db/db+TSF组24h尿白蛋白出现下降趋势(P<0.01),至给药12周时与db/m组更接近(P<0.05)。 PAS染色可见db/db组肾小球体积增大,系膜基质增生,半定量结果表明肾小球系膜基质百分比显著升高(P<0.01),糖肾方治疗后肾小球系膜基质百分比降低(P<0.01)。(2)抗氧化应激机制：TBA法检测MDA水平发现,db/db组小鼠血清、24h尿液MDA均较db/m组显著升高(P<0.01,P<0.001),糖肾方干预可使其含量显著下降(P<0.05,P<0.05)。实时荧光定量PCR结果显示,db/db组小鼠肾组织Nox2、Nox4、 p22phox mRNA水平较db/m组小鼠显著升高(P<0.01,P<0.05,P<0.01),但p47phox无差异(P>0.05),糖肾方干预可降低Nox2、Nox4、p22phox mRNA水平(P<0.001,P<0.05,P<0.01)。Western blot与免疫组化结果显示,与db/m组相比,db/db组肾组织Nox2、Nox4蛋白表达升高(P<0.05, P<0.001; P<0.05, P<0.001),糖肾方可下调其表达(P<0.05, P<0.001; P<0.05,P<0.001)。实时荧光定量PCR发现,与db/m组相比,db/db组小鼠肾组织Nrf2、QO1mRNA升高(P<0.05,P<0.01),db/db+TSF组上述指标显著下降(P<0.05,P<0.05)；db/db组HO-1 mRNA水平较db/m组下降(P<0.05),糖肾方干预可升高其表达(P<0.05)。Western blot与免疫组化显示,糖肾方可下调db/db组肾组织内升高的Nrf2、NQO1蛋白表达(P<0.05, P <0.001;P<0.05,P<0.001)。此外,免疫组化还显示,MIOX表达于近端肾小管,Western blot与免疫组化均证实db/db组小鼠肾小管内MIOX显著增多(P<0.01,P<0.001),而糖肾方可使其降低(P<0.05,P<0.001)。(3)保护足细胞机制：实时荧光定量PCR显示,db/db组小鼠肾组织nephrin、podocin、 WT-1 mRNA水平均较db/m组显著下降(P<0.05,P<0.05,P<0.05),而糖肾方治疗可使其表达升高(P<0.01,P<0.01,P<0.05)。免疫组化结果同样证实糖肾方具有升高db/db组小鼠nephrin> podocin表达的作用(P<0.01,P<0.01)。2. MIOX介导高糖诱导的肾小管上皮细胞氢化应激发生(1)高糖刺激对MIOX表达的影响：随着葡萄糖浓度升高,NRK52E细胞MIOX、Nox4表达逐渐升高,Nrf2表达逐渐下降；30 mM葡萄糖刺激NRK52E细胞0、12、24、36、48、60h,细胞内MIOX、Nox4、Nrf2表达均先升高后降低,Nrf2在刺激12h升至高峰,48h时下降显著,MIOX、Nox4至48h时出现表达高峰。(2)敲降MIOX对细胞氧化应激的影响：筛选得到敲降效率最高(72.1%)的MIOX基因siRNA Oligo干扰序列,转染至NRK52E细胞,6h后更换终浓度5.5及30 mM葡萄糖培养基,48h后发现,细胞内ROS含量及MIOX、Nox4、NQO1蛋白表达升高,Nrf2表达下降,敲降MIOX可降低ROS水平及Nox4、NQOl表达,Nrf2表达较高糖刺激进一步下降。3.受试者招募、数据管理、多级监查、研究者和受试者依从性是试验实施过程中质量控制的重要环节。结论：1.糖肾方可降低自发性2型糖尿病模型db/db、鼠尿白蛋白排泄,改善肾组织病理损伤,具有肾脏保护作用,其机制可能与改善血脂紊乱、减轻氧化应激、降低MIOX表达、保护足细胞损伤有关。2. MIOX可促进高糖引起的肾小管上皮细胞氧化应激反应,其作用与促进Nox4表达有关,这一结果为进一步探索中药作用靶点提供了新思路。