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新生儿缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)是造成新生儿死亡，形成脑性瘫痪、先天性认知障碍、生长迟缓、智力低下及癫痫等神经系统后遗症主要原因，但现在仍然没有有效的措施能够改善因围产期窒息所致的神经系统后遗症。我们通过建立新生鼠缺氧缺血性脑损伤动物模型，探讨基质衍生因子-1(SDF-1)及Nogo受体拮抗剂(NEP1-40)与缺氧缺血性脑损伤的相关研究。 第一部分SDF-1对新生小鼠缺氧缺血性脑损伤的神经保护作用研究 目的:SDF-1在中枢神经系统缺血和缺氧等损伤后，发挥清除坏死组织和促进损伤修复的作用。本研究旨在探讨SDF-1对新生小鼠HIBD后表达变化规律及其与HIBD后细胞凋亡及增殖的相关机制。 方法:将7日龄新生小鼠，随机分为空白组、缺氧缺血性脑损伤(HIBD)组、SDF-1干预组，每组40只。HIBD组及SDF-1干预组小鼠制备缺氧缺血性脑损伤模型。造模成功后30min立即给予腹腔注射SDF-12.0μg/d，间隔24小时后再次给予，连用7d;空白组与HIBD组腹腔注射生理盐水。在脑缺氧缺血后24h、3d、7d、14d处死小鼠。采用(1) HE染色检测脑组织病理损伤程度;(2)RT-PCR技术及免疫荧光技术检测海马组织SDF-1 mRNA及蛋白表达;(3)Western Blotting及免疫荧光技术检测凋亡蛋白酶caspase-3;(4)免疫荧光技术检测Ki67表达;(5)并于造模后14d通过跳台实验及高架十字迷宫实验观察小鼠缺氧缺血性脑损伤后神经功能恢复情况。 结果: 1.HE染色结果空白组小鼠脑组织结构层次清晰，细胞排列整齐，形态正常;HIBD组小鼠脑组织在HIBD后神经细胞排列散乱，空泡化，坏死，核固缩和核碎裂;SDF-1治疗减轻脑组织病理损伤程度。 2.免疫荧光方法观察SDF-1蛋白的表达低倍镜下小鼠分别于纹状体，海马，齿状回，胼胝体及白质区域出现绿色的SDF-1表达阳性细胞。正常小鼠SDF-1阳性细胞分布较稀疏。HIBD组缺氧缺血后，SDF-1阳性细胞数量明显增多。在造模后24时，SDF-1阳性细胞数量出现明显的增多，出现在缺血侧纹状体及海马;于3d时达到高峰，主要在缺血侧纹状体，海马及齿状回区域，7d时有所回落，仅见外囊，胼胝体及白质区少量表达。SDF-1干预组免疫阳性细胞表达区域与HIBD组相同，24h，3d，7d时阳性细胞数量较对照组增多，差异具有统计学意义(P＜0.05)。 3.RT-PCR检测SDF-1mRNA的表达水平各组在不同时间点大脑结扎侧海马均有SDF-1 mRNA及表达。空白组各时间点可见少量SDF-1mRNA表达，HIBD组，24h，3d，7d海马组织SDF-1mRNA表达均较空白组有明显增加(P＜0.05)，3d时增加最为显著，之后表达回落。SDF-1干预组SDF-1mRNA较对照组表达增强，7d时表达降低不显著，与HIBD组比较差异显著(P＜0.05)。 4.免疫荧光及Western Blotting检测各组海马组织Caspase-3蛋白表达的结果Caspase-3免疫荧光染色结果发现:空白组小鼠仅见散在分布的绿色的caspase-3表达阳性细胞。在缺氧缺血后24小时，caspase-3阳性细胞数量明显增多，随着时间延长，阳性细胞数量逐渐减少;SDF-1干预组能明显减少caspase-3阳性细胞数量，与HIBD组相应时间相比差异具有统计学意义(P＜0.05）。 Caspase-3蛋白Western Blotting结果与免疫荧光染色看到相同的结果。 5.免疫荧光检测Ki67阳性细胞正常小鼠脑室管膜下区仅见少量Ki67阳性细胞，分布较稀疏。HIBD组缺氧缺血后3d，Ki67阳性细胞数量明显增多，于7d时达到高峰，14d阳性细胞数量减少，与7d时比较，差异具有统计学意义(P＜0.05）。SDF-1组在缺氧缺血后Ki67阳性细胞数量也出现明显的增多，7d达高峰后略下降，14d时Ki67阳性细胞数较7d差异无统计学意义（P＞0.05）。 6.免疫荧光检测TGFβ1表达水平空白组各时间点几乎没有TGFβ1的表达;HIBD组24h表达很弱，后逐渐升高，3d时达到高峰，7d时消失。SDF-1组在HIBD后24h即达到高峰，3d时仍持续高表达，与相应时间点HIBD组比较，有统计学意义(P＜0.05)，与同组24h相比，差异不显著（P＞0.05）。 7.神经行为学结果在跳台实验中，以足错误次数判断学习能力，错误次数越少，表示学习能力强;24h后对动物记忆再现，以潜伏期判断学习能力，潜伏期长，表示记忆能力好。HIBD组小鼠足错误次数多，24h后对动物记忆再现的观察结果也表明，HIBD组小鼠潜伏期缩短，错误次数增加，记忆成绩下降，与空白组比较差异具有统计学意义(P＜0.05）。SDF-1干预组小鼠错误次数减少，潜伏期延长，学习成绩及记忆能力都较HIBD组提高。 在高架十字迷宫实验中，HIBD组与空白组小鼠相比较，探究行为少，进入开臂的次数及时间百分比均减少，且差异具有统计学意义(P＜0.05)。SDF-1干预组小鼠探究行为增多，进入开臂的次数及时间百分比均较HIBD组提高，且差异具有统计学意义(P＜0.05）。 结论: 1.SDF-1在新生小鼠缺氧缺血性脑损伤后的脑组织中表达明显增加，先呈递增趋势，后逐渐下降。 2.外源性给予SDF-1能够减轻HIBD后脑组织病理损伤程度。 3.SDF-1能够抑制凋亡蛋白酶caspase-3的表达，抑制神经细胞凋亡。 4.SDF-1能够促进缺氧缺血性脑损伤后内源性神经干细胞细胞增殖。 5.SDF-1能够促进缺氧缺血性脑损伤后学习记忆能力等神经功能改善。 第二部分、Nogo-A及Nogo受体拮抗剂与新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后中枢神经再生的相关性研究 目的:中枢神经损伤后有限的再生能力是新生儿缺氧缺血性脑损伤(HypoxicIschemic Brain Damage，HIBD)的主要原因，Nogo-A是重要的神经神经再生抑制因子。本研究旨在探讨Nogo-A在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后的动态表达变化，及Nogo受体拮抗剂对HIBD后促进神经再生的作用。 方法:将7日龄新生大鼠，随机分为空白组、缺氧缺血性脑损伤(HIBD)模型组、NEP1-40干预组及神经节甘酯(GM-1)干预组，每组8只。HIBD组、NEP1-40组及GM-1组大鼠制备缺氧缺血性脑损伤模型。造模成功后立即给予NEP1-4012.5μg/d，GM-110mg/(kg.d)腹腔注射，间隔24小时后再次给予，连用3天或7天;空白组与HIBD组腹腔注射生理盐水。在脑缺氧缺血后6h、24h、72h、7d处死大鼠。采用原位杂交技术检测Nogo-A mRNA及免疫组织化学染色技术检测Nogo-A阳性细胞表达;透射电镜观察脑神经细胞生长情况。 结果: 1.脑组织中Nogo-A-mRNA阳性细胞的表达原位杂交脑组织片中Nogo-A mRNA阳性细胞特点为细胞核棕黄色颗粒，在海马、皮质等部位呈聚集状态。空白组Nogo-A mRNA呈基础性表达，散在分布于脑组织神经元及胶质细胞中。HIBD组Nogo-A mRNA阳性细胞在造模早期6h即明显上升，24h、72h及7d神经元及胶质细胞胞浆中表达大量显色强阳性棕黄色颗粒，呈明显的递增趋势，与同时段空白组比较均有统计学意义(P＜0.05)。NEP1-40治疗组能抑制HIBD后脑组织Nogo-A mRNA阳性细胞表达与同时段HIBD组比较有统计学意义（P＜0.05）。GM-1组脑组织切片Nogo-A mRNA阳性细胞在早期亦升高，至24h时达高峰，然后开始下降;与同时段HIBD组比较有统计学意义(P＜0.05）。 2.免疫组化染色空白组Nogo-A蛋白阳性细胞呈棕黄色颗粒，呈基础性表达，散在分布于神经元及小胶质细胞胞浆和突起中。HIBD后Nogo-A蛋白在大脑皮层、海马及胶质细胞中强阳性表达，并且具有一个动态演变规律，6h、24h、72h及7d呈明显的递增趋势。NEP1-40组Nogo-A阳性细胞数量明显减少，显色呈弱阳性，与对应时期HIBD组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。GM-1治疗组6h时Nogo-A阳性细胞数量明显增多，与HIBD组无统计学差异（P＞0.05），与NEP1-40组相比数量增多，差异具有统计学意义(P＜0.05); GM-1组脑组织切片Nogo-A的阳性细胞数上升至高峰，而24h时段NEP1-40组阳性细胞表达降低，但两组比较有显著意义(P＜0.05);72h、7d虽然GM-1组已呈下降趋势，但较NEP1-40组仍有差异，统计学比较有意义(P＜0.05）。GM-1抑制HIBD后Nogo-A表达的发生较迟后。 3.透射电镜观察脑神经细胞生长HIBD组神经元形态不规则，空泡化，多量凋亡小体，神经细胞轴突溶解，破裂。NEP1-40组6h时与同时段HIBD组改变不明显;24h时脑组织开始出现修复，神经元胞体大小逐步趋于正常，出现胶质细胞增生，神经细胞轴突再生明显，轴突增多，增粗，增长，少见凋亡细胞，7天时脑组织已有明显修复。GM-1组6h时与同时段HIBD组改变不明显;24h时神经元形态不规则，胞体肿胀明显，核形规则，核质溶解，可见较多凋亡小体，无轴突再生;72h及7天时也发生组织修复，神经元肿胀渐消失，胶质细胞轻度增生，但轴突再生不明显。 结论: 1.新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后脑组织中Nogo-A mRNA及Nogo-A阳性细胞数量明显增多，6h、24h、72h及7d呈明显的递增趋势，与抑制神经元轴突再生有关系。 2.NEP1-40能同时特异性抑制Nogo-A等神经抑制蛋白与NgR的结合，拮抗NgR介导诱导轴突生长锥溃变作用，促进神经元轴突再生，减轻脑损伤程度。 3.神经节苷脂治疗HIBD有一定效果，部分降低Nogo-A表达，可以减轻脑水肿，减少神经细胞凋亡。但GM-1发挥作用晚于NEP1-40。