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背景和目的原癌基因Bmi-1(B-cell specific moloney leukemia virus insertion site 1, Bmi-1)属于转录抑制因子Polycomb家族,人类Bmi-1基因定位于10p11.23,由10个外显子组成,cDNA全长3568bp,位于640-1620bp之间的开放阅读框编码一个含326个氨基酸,相对分子量为45kD的核蛋白质。序列同源性对比显示,人和小鼠的Bmi-1在DNA水平和氨基酸水平上同源性分别为86%和98%。Bmi-1蛋白有氨基端环指结构和中心区H-T-H结构域,这对细胞复制寿命的延长和对抑制p16INK4a是必须的。实验证实INK4a/ARF位点是Bmi-1基因的下游调控位点,直接受Bmi-1的负调控而影响细胞增殖和衰老。当Bmi-1高表达时,p16 INK4a表达下调,促进cyclinD与CDK4／6形成复合物,通过p16 INK4a/cyclin D/Rb通路,促进细胞的生长和增殖；Bmi-1高表达还抑制p19ARF,通过p19ARF/MDM2/p53通路,阻止细胞周期停滞和细胞凋亡。研究发现在许多肿瘤中存在Bmi-1基因的高表达,Bmi-1高表达提示预后不良。研究表明Bmi-1是通过作用于INK4a/ARF基因位点而影响细胞增殖及衰老的,并且,Bmi-1基因的表达水平还与肿瘤的侵袭、转移密切相关。因此,本实验拟利用RNA干扰技术,沉默胃癌BGC823细胞Bmi-1基因的表达,观察这种沉默对胃癌BGC823细胞衰老和转移的影响。实验方法根据RNA干扰目标序列的选取原则,利用Dharmacon公司提供的RNA干扰设计软件siDESIGN Center, (http://www.dharmacon.com/designcenter/ designcenterpage. aspx)对Bmi-1序列进行设计。经过BLAST同源性分析,确定RNA干扰靶序列。合成2对Bmi-1基因靶向RNA干扰序列的DNA单链,退火成双链发卡样DNA；利用BamHI和XhoI酶切位点,将其重组入RNA干扰载体pRNAT-U6.2;利用pRNAT-U6.2的插入鉴定引物进行PCR扩增筛选得到重组子pRNAT-U6.2-si1104和pRNAT-U6.2-si1356;对重组子的插入序列进行DNA序列测定,并与设计序列做同源性比较。利用脂质体LipofectAmineTM2000包裹,将pRNAT-U6.2-si1104和pRNAT-U6.2-si1356转入人胃癌BGC823细胞中,同时设立空载体对照组(转染空载体pRNAT-U6.2的胃癌BGC823细胞)和空白对照组(未转染人胃癌BGC823细胞)；RT-PCR和Western-Blot方法检测各组细胞Bmi-1 mRNA和蛋白表达水平；细胞衰老染色和Transwell实验分别检测沉默BGC823细胞Bmi-1表达对细胞衰老和对细胞浸润转移能力的影响。实验结果1.进过筛选优化设计,确定B-cell specific moloney leukemia virus insertion site 1, Bmi-1 (NM 005180) 1104-1122位(GGAGGAGGTGAATGATAAA)、1356-1364位(GAGAGATGGACTGACAAAT)为Bmi-1 RNA干扰的靶序列。2.PCR扩增筛选得到重组子pRNAT-U6.2-si1104和pRNAT-U6.2-si1356,测序分析其插入序列与设计的RNA干扰发卡样DNA序列完全一致。3.实验1组(转染pRNAT-U6.2-si1104的胃癌BGC823细胞)、实验2组(转染pRNAT-U6.2-si1356的胃癌BGC823细胞)细胞Bmi-1 mRNA的相对表达量分别为0.062±0.009和0.114±0.013；空载体对照组和空白对照组细胞Bmi-1mRNA的相对表达量分别为0.314±0.041和0.321±0.038。实验1、2组细胞Bmi-1 mRNA的相对表达量与2个对照组相比,Bmi-1 mRNA的相对表达量显著降低,统计学分析差异有显著性(P<0.05)。4.未转染的胃癌BGC823细胞和转染空载体pRNAT-U6.2的细胞中Bmi-1蛋白呈现高表达；而转染靶向Bmi-1 (pRNAT-U6.2-si1104和pRNAT-U6.2-si1356)的实验组胃癌细胞中,Bmi-1蛋白表达被显著抑制,其中转染pRNAT-U6.2-si1104的胃癌BGC823细胞中Bmi-1蛋白表达几乎完全被抑制。5.实验1、2组的平均细胞衰老率分别为28.3%±3.9%和25.9%±4.3%,空载体对照组和空白对照组的平均细胞衰老率分别为15.6%±2.7%和17.2%±3.1%；实验1、2组与2个对照组相比平均细胞衰老率显著增加,差异有非常显著性(P<0.01)。6.实验1、2组穿透Matrigel的平均细胞数分别为22.4±4.2和33.6±5.5；空载体对照组和空白对照组分别为74.7±9.3和68.9±10.1。实验1、2组与2个对照组相比,穿透Matrigel的平均细胞数显著减少,差异有显著性(P<0.01)。结论1. Bmi-1 (NM 005180) 1104-1122位(GGAGGAGGTGAATGATAAA)、1356-1364位(GAGAGATGGACTGACAAAT)为RNA干扰的靶序列,构建的RNA干扰载体pRNAT-U6.2-si1104和pRNAT-U6.2-si1356,转染人胃癌BGC823细胞能显著降低细胞Bmi-1基因的表达,是比较为理想的RNA干扰靶位点。2.抑制胃癌BGC823细胞Bmi-1基因表达,可以增加细胞的衰老和降低细胞侵袭、转移的能力。