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目的:近几十年来,糖尿病(Diabetes mellitus,DM)的发病率、致残率和死亡率都在急剧上升,糖尿病患者由于多种有害刺激,最终导致糖尿病血管并发症,主要有视网膜病变、肾脏功能下降、足部缺血性溃疡和坏疽等,其中足部缺血性溃疡和坏疽主要是由严重的血液低灌注导致的,与血管缺血性损伤有关,因此促进血管生成从而增加血液灌注是治疗糖尿病足的一种治疗策略。microRNAs(miRNAs)是一种内源性非编码小RNA,可在转录后调控基因表达,在细胞增殖、管形成、迁移等细胞功能中起重要作用。有研究表明miR-328具有调节高糖条件下内皮间质转换、参与房颤后心房重构的过程、肿瘤抑制等作用。本研究旨在观察miR-328对糖尿病缺血细胞模型的血管新生作用及初步探讨其作用机制。方法:我们通过在高糖低血清条件下培养脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)24 h从而模拟糖尿病引起的血管缺血状态,通过CCK-8细胞增殖活性检测实验、划痕实验、管形成实验分别检测在高糖低血清条件培养24 h的和正常条件培养24 h的脐静脉内皮细胞的细胞增殖能力、迁移能力和管形成能力,并且通过RT-qPCR实验检测miR-328分别在高糖低血清条件培养的和正常条件培养的脐静脉内皮细胞中的表达,同时采用Western Blot实验观察血管新生能力标志物血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达和相关通路蛋白的表达;进一步在HUVECs中通过转染NC和miR-328 inhibitor达到对照、下调miR-328表达水平的目的后,两组均在高糖低血清条件培养24 h,再以CCK-8细胞增殖活性检测实验、划痕实验、管形成实验检测在高糖低血清条件培养中脐静脉内皮细胞的增殖能力、迁移能力和管形成能力,同时用Western Blot实验观察下调miR-328后HUVECs中VEGF的表达和miR-328调控血管新生过程中相关通路蛋白的表达,用AKT通路抑制剂Periforsin抑制AKT磷酸化后再观察内皮细胞管形成的变化和AKT/mTOR通路的变化;根据观察内皮细胞的功能实验结果,在miRWalk数据库里(http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/index.html)预测miR-328的靶基因,取Target Scan、miRanda、miRDB、miRWalk中的靶基因的交集作为预测的靶基因,再将这些预测到的靶基因在DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)里进行Gene Ontology功能富集分析和KEGG Pathway分析,最后通过阅读文献,预测miR-328调节高糖低血清条件影响HUVECs血管新生的靶基因并采用WB实验验证靶基因。结果:内皮细胞血管新生功能实验显示:在CCK-8细胞增殖活性检测实验中,在高糖低血清条件下培养的HUVECs增殖活性比正常对照组的HUVECs增殖活性下降,为正常对照组的0.65倍(P=0.0004);在细胞划痕实验中,在高糖低血清条件下培养的HUVECs迁移能力比正常对照组的HUVECs迁移能力下降,为正常对照组的0.81倍(P=0.0003);在内皮细胞管形成实验中,在高糖低血清条件下培养的HUVECs管形成能力比正常对照组的HUVECs管形成能力下降,为正常对照组的0.45倍(P<0.0001);通过RT-qPCR发现在高糖低血清条件下培养的HUVECs中miR-328表达水平较正常对照组的表达水平增高,为正常对照组的4.2倍(P<0.0001);Western Blot实验显示:在高糖低血清条件下培养的HUVECs的VEGF蛋白表达水平比正常对照组HUVECs的VEGF蛋白表达水平下降,为正常对照组的0.4223倍(P<0.0001)。在经过转染NC和miR-328 inhibitor分别达到对照和下调miR-328的目的,并且两组均在高糖低血清条件培养24 h后:在CCK-8细胞增殖活性检测实验中,转染miR-328 inhibitor的实验组较NC组的HUVECs增殖活性上升,为NC组的1.19倍(P=0.0069);在细胞划痕实验中,转染miR-328 inhibitor的实验组较NC组的HUVECs迁移能力上升,为NC组的1.23倍(P=0.0038);在内皮细胞管形成实验中,转染miR-328inhibitor的实验组较NC组的HUVECs管形成能力上升,为NC组的1.28倍(P=0.0006);Western Blot实验显示转染miR-328 inhibitor的实验组较NC组HUVECs的VEGF表达水平上升,为NC组的3.337倍(P=0.0001)。Western Blot实验观察通路蛋白结果显示:高糖低血清组的p-AKT/AKT蛋白比率为对照组p-AKT/AKT蛋白比率的0.76倍(P<0.0001),得出在高糖低血清的条件下,HUVECs的AKT信号通路受到抑制;转染NC和miR-328 inhibitor后,转染miR-328 inhibitor组的p-AKT/AKT蛋白比率为转染NC组p-AKT/AKT蛋白比率的4.1倍(P<0.0001),转染miR-328inhibitor组的p-mTOR/mTOR蛋白比率为转染NC组p-mTOR/mTOR蛋白比率的1.4倍(P<0.05)。用Periforsin抑制AKT磷酸化后:内皮细胞管形成能力受到抑制,AKT/mTOR信号通路受到抑制(P<0.05)。靶基因预测结果中,miRWalk数据库初步得到miR-328的靶基因有183个,进一步Gene Ontology功能富集分析和KEGG Pathway分析显示,miR-328的靶基因主要与细胞对葡萄糖的反应、细胞增殖、细胞迁移、血管新生、细胞周期停等相关,通过查询文献,筛选出可能与内皮细胞血管新生有关的靶基因有:PIM1、MMP16、LYVE1、PTEN,其中我们选择PIM1进行WB实验验证,WB实验结果显示下调miR-328可促进内皮细胞PIM1蛋白的表达(P<0.05);通过KEGG Pathway分析发现,miR-328的靶基因主要涉及的细胞通路有PI3K-Akt signaling pathway、Insulin resistance、AMPK signaling pathway等共8条信号通路,其中AKT信号通路我们已经验证与本实验有关。结论:1.高糖低血清条件抑制内皮细胞的血管新生功能(抑制HUVECs的增殖功能、迁移功能、管形成功能),促进miR-328的表达水平。2.高糖低血清条件中下调miR-328可促进内皮细胞的血管新生功能(促进HUVECs的增殖功能、迁移功能、管形成功能)。3.miR-328调控高糖低血清条件内皮细胞的血管新生是通过靶基因PIM1和AKT/mTOR信号通路实现的。