杨树CEPP多肽的鉴定及其在维管组织发育中的功能分析

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木材是人们日常生活中必不可少的材料,由于其资源少,质量差等问题导致我国木材产量一直处于供不应求的局面,因此,提高木材产量和质量成为我国林木育种工作人员的首要任务。随着分子育种技术的不断成熟,很多优质的树木品种相继推出,但是仍然不能满足国内对木材日渐高涨的需求。近几年,关于植物CEPP(C-terminal End Processed Peptide)多肽激素的研究越来越多。研究表明,CEPP多肽对植物的生长发育具有重要的调控作用,比如,通过人工操纵CLE41-PXY信号途径,可以提高杨树生物量的积累和木材产量。但是,关于CEPP多肽的研究主要集中在草本模式植物中,针对木本植物,尤其是在木材发育过程中的功能研究鲜为人知。为了更加直观的揭示CEPP多肽在木材发育中的调控功能,我们选择木本模式植物——杨树,作为研究对象。目前,CEPP多肽在杨树中的研究相对较少,只有部分CLE家族成员已被报道。因此,本研究首先将所有潜在的CEPP多肽家族,在毛果杨基因组中进行 BLAST,一共确定了包括 C-terminally Encoded Peptide(CEP)、CLAVATA3/EMBRYO SURROUNDING REGION-RELATED(CLV3/CLE)、CLE-like(CLEL)、INFLORESCENCE DEFICIENT IN ABSCISSION(IDA)、Phytosulfokine(PSK)和 Plant Peptide containing Sulfated Tyrosine(PSY)多肽家族在内的 100 个同源基因。通过基因结构与序列比对分析发现在不同物种间,每个多肽家族内部基因结构和motif序列均比较保守,而不同家族motif序列也存在一定的保守性。通过进化分析发现CEPP多肽起源于低等的陆生维管植物,表明它们具有调控植物维管组织发育的潜在功能。PtrCEPP(CEPP in Populustrichocarpa)多肽基因在杨树中的组织特异表达分析,对CEPP多肽调控植物维管组织发育的功能作了进一步的印证。基于每个多肽家族的研究进展及其在杨树中的组织特异表达分析,我们选择其中一个多肽家族——PtrCLEL家族,进行系统的功能分析。分别用PtrCLEL多肽体外处理拟南芥和杨树幼苗,发现 PtrCLELs 和 AtCLELs(CLELs in Arabidopsis thaliana)在拟南芥根系中的功能是保守的,均能导致波浪根表型。而在杨树中,PtrCLELs除了产生波浪根外,还导致根系增粗、变短、侧根成簇排列。通过组织学分析发现根系增粗表型是由于PtrCLELs促使皮质和真皮细胞增多,以及假皮层的形成所致。令人惊喜的是,PtrCLELs改变了杨树根系中柱的韧皮部极性,由3个极变为4个,预示了它们可能参与调控杨树维管组织的发育。通过组织特异表达分析,我们选定PtrCLEL9a和9b作为研究对象,挖掘其在杨树维管组织发育中的功能和信号途径。启动子GUS分析显示,PtrCLEL9a主要在杨树组培苗茎、叶脉中表达,在根中不表达,而土培苗茎段切片显示,它在茎中不表达。PtrCLEL9b在杨树组培苗茎、叶脉、顶芽、和根中均表达,土培苗茎段切片显示,它在初生韧皮部特异表达。PtrCLEL9a和9b过表达均导致杨树组培苗根系异常,PtrCLEL9a过表达产生芽状根,侧根短且成簇存在;PtrCLEL9b过表达导致根系增粗,侧根数量减少。PtrCLEL9a和9b过表达导致杨树茎干倒伏,通过形态学、力学、组织学和化学分析显示,过表达植株茎节从初生生长至次生生长过渡期开始变短,与此同时,茎节穿刺力也开始变大,茎节髓开始出现木质化现象;次生木质部占维管组织的比例降低,茎干木质素和纤维素含量有所降低。通过观察拟南芥PtrCLEL9a和9b过表达株系的表型,发现相对于野生型,其株高变矮,下胚轴次生生长受阻,木质纤维细胞严重减少,这些表型与杨树相一致。利用PtrCLEL9a和9b多肽处理其拟南芥潜在受体突变体发现,PtrCLEL9a和9b促进拟南芥幼苗下胚轴中柱细胞数量增加依赖于PHLOEM INTERCALATED WITH XYLEM(PXY)和 BARELY ANY MERISTEM 3(BAM3),RGFR RECEPTOR 5(RGFR5)可能也参与该过程,而RGFR2和RGFR4抑制该过程。PtrCLEL9a和9b抑制拟南芥成熟下胚轴的次生木质部发育依赖于RGFRs。本研究在杨树中确认了 CEPP多肽基因,并挑选出可能参与杨树维管发育调控的候选基因,为将来CEPP多肽的深入研究奠定了基础;发现PtrCLEL多肽在杨树和拟南芥根中出现功能分化,为CEPP多肽在杨树中的功能研究提出警示;证明了PtrCLEL9a和9b抑制植物维管组织的次生生长,对木材的形成有重要的参考意义。
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