【摘 要】
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木质纤维素是一种自然降解缓慢的可再生资源,其堆积与焚烧对环境产生了不利影响,同时也造成了资源浪费。利用纤维素酶处理木质纤维素可实现资源转化,对资源的再生利用和环境保护具有重要意义。但纤维素酶酶活力低下和高生产成本极大的限制了纤维素酶对纤维素资源的充分利用。本文主要研究如下:1、本研究从水稻秸秆中筛选到三株产纤维素酶菌株,其中两株细菌分别命名为Xh-16和Xh-12,一株真菌命名为Ti-11。经16
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木质纤维素是一种自然降解缓慢的可再生资源,其堆积与焚烧对环境产生了不利影响,同时也造成了资源浪费。利用纤维素酶处理木质纤维素可实现资源转化,对资源的再生利用和环境保护具有重要意义。但纤维素酶酶活力低下和高生产成本极大的限制了纤维素酶对纤维素资源的充分利用。本文主要研究如下:1、本研究从水稻秸秆中筛选到三株产纤维素酶菌株,其中两株细菌分别命名为Xh-16和Xh-12,一株真菌命名为Ti-11。经16/18S r DNA分子生物学鉴定,确定菌株Xh-16属于芽孢杆菌,菌株Xh-12属于不动杆菌,菌株Ti-11属于草酸青霉菌。其最高纤维素酶活力分别为0.76 IU/m L、0.45 IU/m L和0.84 IU/m L。细菌产酶周期短,真菌产酶周期较长。草酸青霉菌Ti-11在酸枣仁、黄芪和连翘叶三种中药渣中均生长良好,纤维素酶生产受到诱导,其中在连翘叶渣中产酶量最高,达到2.07 IU/m L。2、Bacillus Xh-16产纤维素酶条件优化表明,最佳碳源为麦麸,最佳氮源为干酪素,最佳接种量为3%、最佳温度为35℃、最适p H为7.0、最佳转速为180 rpm。响应面实验发现温度和p H值是影响纤维素酶酶活力的显著因素,其中温度和p H值的交互作用对纤维素酶酶活力也显著。实际获得的纤维素酶酶活力为1.35 IU/m L,与预测值接近,证明模型预测有效。Bacillus Xh-16纤维素酶活力相较于优化前提高了77.63%,优化效果显著。酶学特性结果显示,最适反应p H为6.0、最适反应温度为60℃。该纤维素酶具有良好的p H耐受性和热稳定性。Mn2+、Mg2+、Zn2+和Fe2+对纤维素酶活力有促进作用,其中Mn2+促进作用最强,纤维素酶活力提升了30%左右,而K+和Cu2+对纤维素酶活力有抑制作用。纤维素酶粗酶液有效提高了中药渣总黄酮的提取率,酶解90 min时,总黄酮提取率达到最高8.23%,相较于空白对照组提高了43.13%,并且随着加酶量的增加总黄酮提取率继续上升。3、从Bacillus Xh-16中克隆获得内切葡聚糖酶基因Cel5L,全长1500 bp,编码499个氨基酸。将基因Cel5L构建在p ET-32b（+）表达载体中,导入大肠杆菌BL21（DE3）获得重组菌株。经诱导后,内切葡聚糖酶基因Cel5L实现了异源表达,SDS-PAGE显示该蛋白为55 k Da。4、生物信息学分析表明,内切葡聚糖酶基因Cel5L编码的蛋白的分子式为C2456H3811N671O761S10,包含7709个原子,分子质量为55234.91道尔顿;氨基酸数量是499个,理论等电点p I为8.37,不稳定指数为25.43（＜40）,脂肪系数为74.69,平均亲水系数为-0.570。标准分泌信号肽（Sec/SPI）的概率为99.37%,切割位点是ASA-AG（29-30）,概率为90.50%。潜在的磷酸化的位点共有59个,其中丝氨酸有26个,苏氨酸21个,酪氨酸12个。在所编码的蛋白二级结构中,无规卷曲所占比重较多,α-螺旋和延伸链比例适中,β-转角占比较少,三级结构预测结果与二级结构预测一致。亲疏水性显示该蛋白为亲水性蛋白,亚细胞定位显示定位于分泌通路的可能性是4.500,说明很可能蛋白为分泌蛋白。
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