第一部分Etfdh(h)c.250 G>A基因敲入RR-MADD小鼠模型的建立及其病理机制研究研究背景多种酰基辅酶 A 脱氢缺陷(Multiple acyl-coenzyme A dehydrogenation deficiency,MADD),又称戊二酸尿症Ⅱ型。是一种常染色体隐性遗传的脂肪酸代谢障碍疾病。MADD的临床表现多样,通常被分为三型:Ⅰ型为伴有先天性畸形的新生儿型;Ⅱ型为不伴有先天性畸形的新生儿型;Ⅲ型为晚发型。晚发型多种酰基辅酶A脱氢缺陷为中国人群中最常见的类型,以肌无力,运动不耐受,肝肿大,发作性呕吐,低血糖及代谢性酸中毒为主要特征。在晚发型MADD中,高剂量核黄素治疗对其中部分患者具有戏剧性的治疗作用,我们将这一类型 MADD称为核黄素反应性 MADD(riboflavin-responsive MADD,RR-MADD)。自从2007年首次报道后,约80%的RR-MADD被确定是由ETFDH基因突变导致的。ETFDH基因负责编码电子转运黄素蛋白泛醌氧化还原酶(electron transfer flavoprotein-ubiquinone oxidoreductase,ETF-QO),它负责将线粒体基质中各种电子转运黄素蛋白携带的电子传递到位于线粒体膜上的泛醌池。至今为止,已有80多种ETFDH基因突变被确定与RR-MADD相关。其中,c.250G编码氨基酸在各个物种中均保守,且大多数携带c.250G>A点突变的患者为该位点的纯合突变,提示该位点对于蛋白的正常功能发挥有重要的作用。在2012年,Olsen的团队应用人类HEK-293细胞对RR-MADD的致病及核黄素治疗机制进行了研究,提出了蛋白质折叠缺陷假说:与RR-MADD相关的ETFDH突变使得ETF-QO蛋白出现折叠缺陷,从而导致电子泄露及活性氧自由基的产生。此外,她的团队在细胞实验中证明了黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)可以纠正分子伴侣介导的蛋白折叠过程并稳定突变的ETF-QO蛋白结构。既往这些研究对于了解RR-MADD的发病及核黄素治疗机制有着重大的作用。然而仍然有很多现象无法仅仅靠ETFDH基因突变来解释:早在ETFDH基因突变被确定为RR-MADD致病原因之前,已经有学者发现在部分患者的体内存在线粒体及细胞内的黄素腺嘌呤单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸的缺陷。最近的一些研究也发现了除ETFDH基因突变外,一些涉及黄素转运的基因以及FAD合成基因的突变也可以引起RR-MADD。这些证据提示了 FAD稳态在RR-MADD的发病中可能扮演着一定的角色。更有趣的是,在临床上,1个月高剂量核黄素治疗足以纠正RR-MADD患者的各种临床症状,且患者不需长期服药,停药后症状并不会短期复发。这些现象,都无法用单一的ETFDH基因突变来解释。此外,体外实验无法完全模拟人体内复杂的代谢通路,因此利用其研究MADD的发病机制受到很大限制,而在体的实验研究对于MADD发病机制的阐明具有很大的研究优势。为了解决这些问题,我们首次建立了携带人类p.A84T(c.250G>A)点突变的Etfdh基因敲入小鼠,并利用小鼠模型分析了 ETFDH基因突变导致RR-MADD发病的具体分子机制;通过分析核黄素治疗前后小鼠各项病理指标和生化指标变化,探讨核黄素纠正遗传代谢缺陷的作用机制。实验方法1.构建基因打靶技术需要的基因敲入载体:本载体设计通过基因打靶技术,在小鼠第3号外显子,精确引入与中国人群ETFDH c.250G>A热点突变相同的引起氨基酸p.A84T改变的突变。2.基因敲入载体导入胚胎干细胞,经过筛选获得发生正确同源重组的胚胎干细胞。3.制备嵌合型小鼠:将获得的发生正确同源重组的ES细胞显微注射入C57BL/6小鼠的囊胚中,经注射的囊胚在假孕母鼠的子宫中生长,成为嵌合型小鼠。4.获得Etfdh(h)c.250G>A突变杂合子小鼠:嵌合体小鼠与另一只C57BL/6小鼠交配,产生出后代。用PCR方法筛选出Etfdh(h)c.250G>A基因敲入小鼠,这些小鼠被称为F1代。将F1代小鼠与CMV-Cre小鼠杂交,以去除插入的Neo元件。5.Etfdh(h)c.250G>A突变杂合子小鼠互交,获得Etfdh(h)c.250G>A(p.A84T)突变纯合子小鼠及其同窝对照鼠。6.制备特殊成分饲料,以模拟应激状态诱发小鼠MADD发病:以美国营养学会AIN-93G标准生产的小鼠纯化型标准饲料为基础,对其成分进行调整,制备高脂(highfat,HF)饲料,维生素 B2 缺乏(VitaminB2deficiency,B2D)饲料,及高脂并维生素B2缺乏(HF-B2D)饲料。7.观察小鼠体重及生存期:在诱导前,诱导中及维生素B2治疗过程中,每周同一时间检测小鼠体重,观察其体重变化。并观察各种饮食及核黄素治疗对小鼠生存期的影响。8.应用转棒实验检测小鼠行为学:通过检测小鼠成功完成5min30rmp测验的比例来检测该小鼠运动功能。9.应用液相色谱-质谱分析血液内酰基肉碱的含量。10.肌肉及肝脏组织进行组织化学染色,以观测其组织学改变情况。11.应用实时定量PCR检测小鼠在各种饮食条件下及核黄素治疗前后肝脏及肌肉组织内EtfdhmRNA表达量。12.蛋白westernblot电泳检测小鼠在各种饮食条件下及核黄素治疗前后肝脏及肌肉组织内ETF-QO蛋白含量的变化。13.HPLC检测小鼠肝脏及肌肉组织内FAD含量变化情况,以阐明FAD与RR-MADD发病-缓解之间的关系。实验结果1.Etfdh(h)A84T/+杂合小鼠互相交配,成功获得294只后代小鼠。其基因型分布情况符合孟德尔遗传定律。证明该位点纯合突变并非胚胎致死性突变。2.未经饮食诱导的纯合子小鼠不表现MADD特征。3.经HF-B2D饮食诱导的基因敲入纯合子小鼠表现类似人类MADD特征。HF-B2D组纯合子小鼠体重明显减轻,且其中位生存期明显缩短。血酰基肉碱检测显示中长链酰基肉碱升高,而短链酰基肉碱和游离肉碱减少;肝脏肿大,肝脏脂肪化;肌肉病理切片H&E染色显示肌纤维直径减小,肌内膜明显增生,ORO染色示小鼠肌纤维内脂滴增多,SDH氧化酶活性较对照组降低。而其它饮食组纯合子小鼠体重、生存期、血酰基肉碱、肝脏病理及肌肉病理均未见明显异常。4.大剂量核黄素治疗后,MADD小鼠恢复正常。在特殊饲料诱导5周后,部分HF-B2D组纯合子小鼠给予0.1mg/(g.d)核黄素灌胃治疗。治疗3天后,小鼠体重开始上升,2周后恢复至特殊饮食前体重。持续灌胃21天后,该小鼠体内中长链酰基肉碱含量明显下降,短链及游离肉碱水平恢复至正常,肝脏重量恢复正常,肝脏细胞脂肪变性较治疗前明显减轻。肌肉病理切片染色示肌纤维大小恢复正常,肌间质恢复正常,ORO染色未见明显脂滴,SDH氧化酶活性恢复正常。5.纯合子小鼠体内Etfdh mRNA拷贝数在各个饮食组间均未见明显差异,同一饮食组内的纯合子及同窝对照组间亦未见明显差异。无论在任何饮食组,纯合子鼠肝脏及肌肉组织内ETF-QO蛋白表达量均较同窝野生型低,而且,在维生素B2缺乏的条件下(B2D及HF-B2D组),纯合子小鼠ETF-QO蛋白表达量较正常维生素B2饮食组内纯合子小鼠进一步降低。补充核黄素21天后,纯合子小鼠肝脏及肌肉内ETF-QO含量明显上升,但仍低于野生型对照鼠。6.HPLC检测小鼠肝脏及肌肉组织FAD含量结果示:当核黄素缺乏时(93G-B2D和HF-B2D),纯合子及对照组小鼠组织内FAD含量均降低,但在HF-B2D组,纯合子体内FAD含量却较同组对照鼠降低更为明显。这个结果证明了脂肪酸氧化压力也对FAD含量有显著影响。当应用核黄素治疗21天后,纯合子及野生型小鼠体内的FAD含量均显著上升。讨论在此,我们首次建立了Etfdh(h)p.84A>T基因敲入小鼠模型,这使得在体研究RR-MADD的发病机制成为可能。最终,纯合子小鼠表现出类似人类MADD的临床特征,核黄素对其症状有戏剧性的治疗效果。在我们的研究中,HF-B2D饮食创造了一种低核黄素-高脂肪酸氧化压力的状态,最终成功诱导纯合子小鼠表现出与人类RR-MADD相似的症状。既往的营养学流行病学调查结果显示,亚临床核黄素缺乏状态在人群中是非常常见的,尤其是在青少年女性中更为普遍;而寒冷、饥饿和疾病都可以导致脂肪酸氧化压力升高。因此,在人群中,核黄素-高脂肪酸氧化压力状态并非罕见。当携带与RR-MADD相关ETFDH基因突变的患者出现这种核黄素-高脂肪酸氧化压力状态时,即表现出RR-MADD相关症状。利用这一小鼠模型我们对RR-MADD的发病机制进行了初步的研究。我们的实验进一步验证了先前体外实验的观点:RR-MADD患者体内ETF-QO蛋白的降低并非由于蛋白质合成减少,而是因为蛋白质分解加快。突变的蛋白结构使得FAD与黄素蛋白的亲和力降低,从而导致FAD与ETF-QO结合发生障碍。有趣的是,在诱导疾病发生的条件下,纯合子小鼠体内的FAD水平较对照鼠明显降低,这一结果证明了在RR-MADD体内存在继发性FAD缺乏。尽管在缺乏核黄素的条件下(93G-B2D和HF-B2D饮食组),所有小鼠组织内的FAD浓度均较正常饮食降低,但是在HF-B2D组纯合子小鼠体内,FAD浓度降低更加明显,而HF-B2D组纯合子小鼠是唯一一种表现MADD症状的小鼠,治疗后,FAD浓度升高而小鼠症状消失,说明FAD浓度与RR-MADD发病缓解之间存在极为密切的联系。近期的一些研究发现,除了ETFDH外,一些与黄素转运相关的基因及FAD合成过程所涉及的基因突变也可以导致RR-MADD。这些研究和我们的实验结果共同提示了 RR-MADD发病的潜在机制:FAD稳态失衡。在补充核黄素的条件下,体内FAD浓度上升,一方面增加了 FAD参与蛋白折叠的机会,另一方面促进了分子伴侣介导的蛋白成熟,从而增强了黄素蛋白的折叠。另外,在补充核黄素后,与FAD结合增强的成熟黄素蛋白在降解的过程中可以向线粒体基质里释放更多的FAD,因此,在停止核黄素供给后,仍能保持FAD池的充盈。这也部分的解释了为什么在临床上只需2-3个月的核黄素补充就可以纠正RR-MADD的症状,而不需终身服药。第二部分柱状螺旋体肌病病理机制的研究研究背景柱状螺旋体(Cylindrical spirals,CSs)是一种肌纤维内极为罕见的病理结构。直至今天,全世界范围内只报道了 16例相关病例。肌肉内的柱状螺旋体在组织化学染色及电镜检查中表现很特异。光镜下表现为以Ⅱ型纤维为主的肌纤维内或肌纤维膜下的物质蓄积:其在苏木素-伊红(H&E)染色下呈现碱性,在改良格莫瑞三色(mGT)染色下呈现红色,在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸四唑还原酶(NADH-TR)染色下呈现深染或轻微着色,在肌原纤维腺苷三磷酸酶(ATPase)染色下不着色。电镜检查中,柱状螺旋体表现更为特异,其中心为含有糖原颗粒的中央孔,6-30层板层结构围绕中央孔程螺旋状排列。与其病理改变的特异性不同,肌肉活检发现肌纤维内含有柱状螺旋体的患者的临床症状表现极为多样,因此,有些学者认为柱状螺旋体是肌纤维内代谢失衡所导致的反应性改变。但是,患者中肌肉系统相关症状是相对一致的,且柱状螺旋体也曾在家族中集中出现。这些证据暗示了肌纤维内柱状螺旋体的出现也可能是一种原发病理改变,且与遗传因素相关。至今,肌纤维内柱状螺旋体的起源仍然未知。此前有推断柱状螺旋体可能是来源于肌浆网的异常增殖。在本研究中,我们报道了国内首例肌肉活检组织内存在柱状螺旋体的病例,并且应用免疫组织荧光染色的方法,首次验证了柱状螺旋体的起源。实验方法1本研究纳入2位柱状螺旋体肌病患者,2名微管聚集肌病患者及2名正常对照。2对所有入组患者和对照的肌肉活检组织行常规化学染色,观察其肌肉病理学改变。3应用一系列抗细胞内膜系统抗体(包括SERCA1,calsequestrin,RYR1,GM130,myosin,emerin,LC3,lamp2,dystrophin,desmin 等),对肌肉活检组织切片行肌肉组织免疫化学/荧光染色,以探究其起源。4肌肉组织行透射电镜检查,明确其电镜学改变。5从肌肉组织内提取DNA,行相关基因(STIM1,STIM2,ORAI1)突变检测。实验结果1我们报道了国内首例肌纤维内存在柱状螺旋体的病例:患者1、2为同胞姐妹,主要临床表现均为逐渐进展的双侧不对称的肌无力及运动不耐受。肌无力从下肢进展到上肢,从远端发展到近端,左侧重于右侧。CK正常,肌电图表现肌源性损害。双下肢肌肉CT检查结果显示左侧臀大肌和股外侧肌萎缩;双侧胫前肌及腓肠肌脂肪浸润。2两位患者肌肉活检常规染色均可见肌膜下异常物质蓄积。其在H&E染色下呈现碱性,mGT染色下呈现红色,NADH-TR染色浅染,PAS略着色,ATPase、SDH、CCO染色均不着色。3两位患者的肌肉标本电镜检查均显示其肌纤维膜下存在典型的柱状螺旋体。4与微管聚集肌病相比较,柱状螺旋体聚集区域只在抗SERCA1抗体染色显示阳性,而在抗calsequestrin和抗RYR1染色中均为阴性,说明柱状螺旋体来源于肌浆网的长管区。而微管对抗SERCA1、calsequestrin和RYR1抗体染色全部为阳性反应,说明聚集的微管来源于整个肌浆网。5基因筛查显示两位患者均不含STIM1、STIM2和ORAI1基因突变。讨论本研究报道了中国人群中首例肌肉病理活检发现肌纤维内存在柱状螺旋体聚集的病例,并首次提出了柱状螺旋体来源于肌浆网长管区的证据。尽管柱状螺旋体和微管聚集在组织化学染色结果中存在相似性,但我们的研究明确了这两种结构之间成分的差异。肌纤维内的柱状螺旋体对肌浆网长管区蛋白SERCA1具有高度免疫反应性,而对肌浆网交界区蛋白RYR1和calsequestrin没有免疫反应性,这表明其来源于肌浆网的长管区。而微管聚集对所有区域的肌浆网蛋白质(包括SERCA1,RyR1和calsequestrin)都具有免疫反应性,这表明其来源于整个肌浆网。这一结果对临床肌肉病理检查意义重大,其使得临床鉴别微管聚集和柱状螺旋体肌病无需依赖电镜,通过免疫荧光染色即可区分。有趣的是,尽管在所有这些患者中,柱状螺旋体H&E和mGT染色结果高度一致,但其NADH活性却大相径庭。我们回顾了之前发表的柱状螺旋体肌病的文献,总结了 NADH-TR染色和临床病理学之间的相关性:柱状螺旋体NATH-TR浅染的所有6例患者均患有肌肉无力,其伴或不伴肌痛,但均不表现痉挛和肌张力增加。相反,在其他4例NADH-TR深染的患者中,只有1例患有阵发性肌无力和肌痛,另外2例则表现为痉挛或肌张力增高,另1例无症状。之前已有研究证实,在骨骼肌中,NADH可以刺激附近的正常RyR1通道活性从而激发Ca2+释放,这将进一步导致肌肉收缩。这种生理机制可以部分解释NADH活性低的患者存在肌肉无力,而NADH活性高的患者表现为痉挛或肌强直的原因。这种NADH活性与其临床表型之间的关系进一步提示了 NADH活性在柱状螺旋体肌病发生发展过程中有重要作用,这为柱状螺旋体肌病的治疗提供了重要线索。