FADD最初是用Fas细胞内的DD结构域作为诱饵蛋白，通过酵母双杂交筛选发现的一个接头蛋白，在死亡受体介导的细胞凋亡中扮演重要角色。FADD的凋亡作用是分别通过两个独立的结构域—-N端的DED和C端的DD与其上下游蛋白的同源结构域相互作用传递凋亡信号。FADD DED与DD结构的解析帮助我们更好地了解了FADD在细胞凋亡中的作用机制。近年来越来越多的研究表明FADD还在许多非凋亡功能中发挥作用，包括细胞增殖、细胞周期调控、淋巴细胞激活、胚胎发育等生物过程。有研究表明其非凋亡活性与C末端的近20个氨基酸残基的片段有关，尤其是19l位丝氨酸的磷酸化状态直接影响FADD的非凋亡功能。然而，对于C末端在FADD非凋亡中的作用机制却所知甚少，在所有测定的FADD结构中都是C末端缺失的。为了研究C末端的在非凋亡中的作用，我们在原核体系大肠杆菌中表达纯化了全长野生型的FADD和F25Y突变体，并将Ser191分别突变成Ala和Asp，产生的突变体FADD—A、FADD—D分别模拟FADD的不可磷酸化状态与永久磷酸化状态。通过对野生型、各突变体的性质、结构、功能进行系统的分析比较，对FADD的非凋亡活性机理作出初步的解释。 首先通过GST的融合策略，我们表达了N端携有GST的融合蛋白GST—FADD，并通过GST亲和层析得到较纯的产物，但在GST切除的过程中却遇到FADD蛋白沉淀与产生不均一性的问题。改变融合策略，换GST为较小的亲和标签His—tag，避免酶切过程对FADD的伤害。但表达的蛋白与镍亲和层析柱的亲和力非常弱，是导致低产量的直接原因，FADD的回收率仅有5％。利用低浓度尿素不完全变性虽然可以提高蛋白与镍亲和层析柱的结合能力，但复性的效率及质量很低，造成产物的不均一性，不利于进一步的体外研究。对FADD进行改造，将DED结构域缺失或根据文献报道将25位的Phe变成Tyr之后，His—tag与镍柱的亲和力大大提高，回收率达到50％。最终我们得到了比较纯的N端融合有His—tag的FADD及其变体共9个蛋白：FADD(W)、FADD—A(A)、FADD—D(D)，DED结构域缺失变体FADD(80-205)(WC)、FADD—A(80-205)(AC)、FADD—D(80-205)(DC)和25位突变体FADD(F25Y)(WY)、FADD—A(F25Y)(AY)、FADD—D(F25Y)(DY)。利用非变性电泳、尿素电泳、凝胶过滤层析、戊二醛交联等方法对蛋白进行质量与性质上的评价分析，显示W、A、D以可溶的多聚体形式存在，而DED缺失突变体WC、AC、DC及F25Y点突变体WY、AY、DY都以单体形式存在，说明以Phe25为核心的疏水区是介导FADD自身相互作用的关键位点。疏水层析的结果表明，FADD与其变体的疏水表面分布几乎没有差别，都是疏水性非常强的蛋白。 通过圆二色谱对FADD的二级结构分析，FADD及变体表现出显著的α-螺旋蛋白的特征，并且FADD与变体之间CD谱图的相似性又说明我们所涉及的这些突变对FADD的二级结构骨架基本没有影响，无论是Phe25突变成Tyr，还是Ser191突变成Ala或Asp。荧光光谱的分析结果则为我们提供了与三级结构相关的信息。首先内源荧光光谱反映了位于DD结构域的色氨酸周围的微环境在这些蛋白中没有差别。其次利用荧光探针ANS的特性进行外源荧光分析蛋白的可及疏水表面，以及利用内源荧光光谱对盐酸胍变性过程中蛋白结构稳定性的比较，均显示AY、WC是同组蛋白中比较稳定的一个，S191D变体总体表现不如野生型或S191A变体紧闭、稳定。依此推测FADD C末端由于Ser191磷酸化状态的不同，它的柔性也会不同，主要影响FADD结构的紧闭性与稳定性。 体外His pull-down实验的结果表明我们表达纯化的变体蛋白能以与文献报道一致的方式同caspase—8和CKIα作用，一方面证明了蛋白保有一定的生物活性，适合体外研究，另一方面也反映了点突变F25Y、S191A、S191D不影响FADD与这两个蛋白的结合。 最后我们在真核细胞内对这些蛋白进行了研究，比较了它们在可溶性、定位及凋亡活性等方面所表现的差异。过量表达的FADD可在细胞中形成纤维状的DEF结构，不溶于含去污剂的裂解液，并介导TRAIL诱导的凋亡。而FADD(F25Y)则弥散地分布于整个细胞，以可溶的形式存在，但对TRAIL不敏感。结合前面的结果，进一步证明了Phe25对FADD形成聚体的重要性，及FADD聚集与其凋亡活性的密切关系。实验结果表明：Phe25与Ser191的突交不影响FADD整体的结构折叠，但会改变FADD的局部性质或结构，从而影响FADD的功能。Phe25是FADD自联形成聚体的关键位点，而FADD的聚集能力与FADD的凋亡活性相关，通过破坏FADD聚体的形成可以抑制FADD介导细胞凋亡的能力；C末端Ser191不同的磷酸化状态会改变FADD结构的紧闭程度和稳定性，影响FADD与某种未知蛋白的亲和力，从而造成不同磷酸化形式的FADD在细胞周期、细胞增殖与激活等非凋亡途径中表现出不同的生物活性。