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研究背景干细胞技术是一种以组织再生为核心内容,通过干细胞多向分化能力来修复组织缺陷的技术。骨髓间充质干细胞是干细胞的一种,在一定诱导条件下可诱导分化为软骨组织,骨组织,脂肪组织等,并且具有取材容易,来源广泛,自我更新能力较强,移植时不会发生免疫排斥反应等优点。课题组前期研究发现在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中,长链非编码RNALINC00707的表达水平显著上调,通过生物信息学分析发现LINC00707和miR-370-3p之间可能存在相互作用关系,在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中,文献中尚未见LINC00707和miR-370-3p之间的相互作用的报道。研究目的通过结合前期实验基础,文献综述,生物信息学分析方法,将骨髓间充质干细胞中的LINC00707、miR-370-3p和下游基因WNT2B的表达水平做出实验分析,结合内源性调节竞争机制学说,形成LINC00707/miR-370-3p/WNT2B信号轴调控骨髓间充质干细胞成骨分化的理论,为临床上将骨髓间充质干细胞应用于骨组织缺损修复提供科学依据。研究方法1.LINC00707对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响2.LINC00707和miR-370-3p内源竞争调控骨髓间充质细胞成骨的分子机制3.LINC00707/miR-370-3p/WNT2B信号轴促进骨髓间充质干细胞成骨分化的分子机制研究研究结果1、LINC00707对骨髓间充质干细胞成骨分化的作用研究(1)应用骨诱导培养基诱导培养hBMSCs,实时定量PCR检测结果显示在hBMSCs成骨分化诱导过程中LINC00707的表达量逐渐升高。(2)应用过表达慢病毒转染或干扰质粒转染LINC00707,结果显示,在hBMSCs中转染了 LV-LINC00707后,其成骨分化相关基因RUNX2、OCN、ALP的表达量均发生显著上调(P<0.05),说明LINC00707的表达高低直接影响了hBMSCs的成骨分化能力。2、LINC00707与miR-370-3p内源性竞争调控骨髓间充质干细胞成骨分化的分子机制研究(1)应用生物信息学和在线数据库分析预测发现了 LINC00707可以与miR-370-3p的结合位点相结合,进而直接产生交互作用。(2)应用荧光素酶报告基因检测和AG02-RIP试验证明了 LINC00707可以与miR-370-3p相结合,进而影响下游靶基因的表达。(3)应用过表达慢病毒转染和干扰质粒转染LINC00707,结果显示,LINC00707和miR-370-3p的含量在hBMSCs成骨分化过程中呈现负相关。(4)转染 miR-370-3p mimics 和 inhibitor 后,证明了 miR-370-3p 能够负性调控成骨分化相关基因的表达。(5)应用共转染LINC00707与miR-370-3p,结果发现,LINC00707可以竞争性抑制miR-370-3p对hBMSCs成骨分化的抑制作用。(6)应用共转染sh-LINC00707与miR-370-3p inhibitor,此结果和共转染LINC00707 与 miR-370-3p mimics 的结果相符。3、LINC00707/miR-370-3p/WNT2B信号轴促进骨髓间充质干细胞的成骨分化的分子机制研究(1)应用生物信息学和在线数据库分析预测发现miR-370-3p可以靶向性调控WNT2B的表达。并应用荧光素酶报告基因检测予以验证。(2)转染miR-370-3p结果证明了 miR-370-3p能够负向调控下游靶基因WNT2B的表达。(3)应用小干扰RNA转染WNT2B,结果显示,干扰了 WNT2B的表达后,hBMSCs的成骨分化能力受到明显抑制。结论通过一系列的实验可以成功验证本课题提出的假说,LINC00707可以竞争性逆转miR-370-3p对WNT2B的抑制作用,促进hBMSCs在成骨分化过程中WNT2B的表达,进而促进成骨关键基因RUNX2、OCN和ALP的表达,最终促进hBMSCs的成骨分化。