花生是重要油料作物之一,在世界范围内都有广泛的种植,我国是花生生产大国,年产量居世界首位,花生总产的50%以上用于榨油,花生种子中含油量高达60%以上。含油量直接影响花生油的供给能力和油脂的加工效益,在花生中含油量和脂肪酸的组成及含量是衡量油脂品质的关键指标,为了分析花生油脂代谢相关途径的功能基因及其分子机理,本研究首先对高油和普通花生品种在种子发育、萌发后的不同阶段脂肪酸的积累和降解模式进行了分析,比较了不同含油量品种在不同生长时期脂肪酸组成和含量的差异;并分析了在发育及萌发后不同时期花生子叶细胞中含油量与油体的动态变化;在此基础上利用iTRAQ技术对不同发育时期的籽仁进行蛋白质组学分析,分析不同发育时期蛋白质的动态变化,从蛋白质水平对参与油脂代谢的基因进行分析,探讨不同发育时期油脂积累和萌发后油脂降解的分子机理。重点分析了控制O/L值的功能基因FAD2基因家族,并构建了FAD2基因的CRISPR-Cas9载体,通过农杆菌介导的方法转入花生,欲通过CRISPR-CaS9定点突变技术对花生FAD2基因进行敲除,为进一步培育高油酸花生品种奠定基础。本研究的主要结果如下:1.本研究对高油花生品种花U606及普通含油量品种花17各个发育时期脂肪与脂肪酸组成及含量的分析,结果表明:在种子发育阶段粗脂肪的积累都呈“S”型曲线增长趋势,脂肪酸的组成一致但变化幅度不尽相同,亚麻酸在幼果期能检测到,而在花后40天后基本检测不到。对不同发育时期各种脂肪酸含量与含油量的分析表明,2个品种中各种脂肪酸含量与含油量的变化趋势基本一致;而萌发后油脂降解过程中花U606子叶中脂肪酸成分变化比较明显,且有新的脂肪酸C22:6的生成,而花17中子叶的脂肪酸组分变化不大,说明不同含油量的品种在萌发后不同阶段各种脂肪酸的降解模式不同。通过分析不同含油量花生品种在不同生长发育阶段粗脂肪和脂肪酸的动态变化,探讨了花生中油脂积累和降解过程中脂肪酸组分的变化规律。2.采用尼罗红染色和激光共聚焦技术相结合的方法观察不同含油量品种(花U606和花17)在种子发育及萌发后不同时期油体的动态变化,进一步探讨子叶细胞内油体与含油量的关系,结果表明:2个品种中油体的变化趋势基本一致,只在油体数量及大小上差异明显。随着花生种子的发育,油体逐渐增多直至充满整个细胞且体积变大,而萌发后随着油脂的降解油体数量逐渐减少,30d时仅在细胞壁周围有油体分布。通过对花生子叶细胞内油体含量进行分析,发现随着种子的发育,油体数量逐渐增加,油体含量也逐渐增加;而在种子萌发后不同阶段,油体的数量逐渐减少,油体含量也逐渐减少。结合籽仁不同发育及萌发后不同时期含油量的变化,可知油体含量越高,含油量越高,反之油体含量越低含油量也越低。3.运用iTRAQ技术对花U606不同发育及萌发后共8个时期进行蛋白质组学研究,共鉴定到8505个蛋白,其中5712个蛋白有定量结果,对其进行功能分类可分为23类,其中参与油脂代谢的蛋白有241个,差异蛋白有88个,分别参与油脂的合成、油脂的降解、脂质结合、脂质转运和脂质储存等代谢途径。对花生种子中参与油脂代谢蛋白的表达分析可知,在种子发育早期参与油脂积累的蛋白大都是差异表达的,表明油脂的积累在种子发育早期就开始了。参与油脂降解的蛋白在种子萌发后各阶段大多高丰度表达,主要依赖于脂氧合酶途径。选取参与油脂积累和降解过程中的12个关键蛋白进行qPCR验证,结果表明在种子发育过程中FAD2、KASII、KASIII和oleosin 4个基因与蛋白的表达趋势一致;在种子萌发后各时期,有关油脂积累的基因表达量都较低(除ACCA外),但参与油脂降解的蛋白脂氧合酶(LOX)、磷脂酶(PLD)、GDSL酯酶(GDSL)和乙酰CoA氧化酶(ACOX)在各阶段表达量都较高,和蛋白的表达趋势不尽相同。通过对花生种子不同发育及萌发后各时期蛋白质表达谱的构建,从蛋白质水平上分析参与油脂积累及降解过程中差异蛋白的动态变化。4.花生中控制O/L的重要功能基因FAD2是一个包含较多成员的基因家族,从中鉴定了6个全长FAD2基因的cDNA序列并分析了其结构特征,发现AhFAD2-1,-2,-3和-4位于内质网膜上,AhFAD2-5和AhFAD2-6定位在叶绿体膜上;AhFAD2-2、AhFAD2-3和AhFAD2-4的氨基酸序列有很高的相似性,AhFAD2-1基因在花生种子中高丰度表达,氨基酸序列与前三者也有明显的不同;根据AhFAD2-1基因序列设计sgRNA靶点,构建了该基因的CRISPR-Cas9表达载体,通过农杆菌介导的方法转入花生植株,初步构建了不需经过组织培养直接注射花生花和第一对侧枝基部的转基因方法,通过CRISPR-Cas9系统定点突变AhFAD2-1基因,结果表明:利用该系统可以将目的序列导入花生植株,并且转化效率较高,但CRISPR-Cas9体系对目的基因的编辑效率较低,这可能与sg RNA的引导序列有关,尚需进一步设计不同的引导序列来提高对目的基因的编辑效率。