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该研究尝试用毕赤酵母表达系统进行单宁酶的分泌表达,将来自于米曲霉的单宁酶基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成分泌型表达载体pPIC9K-TAN,然后转化到毕赤酵母菌株KM71中,得到的His<+>菌株再用G41 8筛选抗性克隆,然后进行摇瓶表达,探讨了在不同pH条件下进行诱导以及不同甲醇浓度对单宁酶表达量的影响.鉴于毕赤酵母适合于高密度发酵的特点,我们还进行了重组单宁酶的高密度发酵表达.发酵液上清经超虑浓缩后用DEAE阴离子交换层析纯化,每升发酵液可得约72mg单宁酶样品.对重组单宁酶进行去糖基化分析,从SDS-PAGE分析结果显示,在去糖基化后进行非还原性电泳时,单宁酶的迁移率大约为68kDa,而在进行还原性电泳时,则清楚显示出重组单宁酶由34kDa和31kDa两个亚基构成.我们还对重组单宁酶的酶学性质进行了分析,测定重组单宁酶的酶活力为1.5×10<4>U/g.并对其热稳定性范围,最适反应温度,酸碱稳定范围,最适反应pH等进行了分析.由于甲醇具有一定的毒性,且是易燃物质,存在一定的危险性,而组成型启动子P<,GAP>是近年来成功克隆并得以应用的毕赤酵母高效启动子,为了探讨使用该启动子表达单宁酶的可行性,并探讨载体信号肽序列与单宁酶基因之间的序列对单宁酶的表达及其N端序列的影响,我们构建了表达载体pGAPZαA-TAN及pGAPZαA-ETAN,其中pGAPZαA-TAN中信号肽序列与单宁酶基因直接相连,在pGAPZαA-ETAN中,信号肽序列与单宁酶基因之间保留了Ste13蛋白酶的切割序列EAEA.构建好的载体转入毕赤酵母宿主细胞KM71,从活性筛选结果看,在PGAP启动子介导下,重组单宁酶基因能够在毕赤酵母细胞中成功分泌表达.而其表达量与使用乙醇氧化酶启动子时的表达量的差别,以及信号肽与基因之间的序列对表达的影响仍有待进一步研究.