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目的研究双参宁心胶囊（SSNX）对小型猪心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemical reperfusion injury,MIRI）的保护作用,从 PINK1/Parkin 通路揭示其调控心肌细胞线粒体自噬保护MIRI的作用机制。第一部分双参宁心胶囊对小型猪MIRI的保护作用研究1.材料与方法1.1动物分组与给药雄性巴马小型猪随机分为假手术组、模型组、阳性药组,SSNX预防治疗组,SSNX治疗组,每组各6头。SSNX预防治疗组（20mg·kg-1）于MIRI术前7天给药,其余4组常规喂养7天。第7天,除假手术组外,其余各组予介入球囊阻断心脏冠脉左前降支近端血流制备心肌缺血再灌注损伤模型。SSNX治疗组及预防治疗组动物术后予SSNX（20mg·kg-1）拌饲喂养7天,阳性药组予尼可地尔（1.2mg·kg-1）拌饲喂养7天,假手术及模型组予普通饲料常规喂养7天。1.2 MIRI模型评估于术后15分钟行心电图检测,通过心电图变化评估模型构建是否成功。1.3舌象分析及生化指标测定分别于术前、术后7天采血,酶联免疫吸附法检测血清心肌肌钙蛋白（cTnT）含量,IFCC法检测血清乳酸脱氢酶（LDH）含量,比色法测定血清肌酸激酶同工酶（CK）,免疫抑制法测定肌酸激酶MB同工酶（CK-MB）。全自动血凝仪监测凝血指标凝血酶原时间（PT）活化部分凝血活酶时间（APTT）,血浆纤维蛋白原（FIB）,硝酸还原酶法测定一氧化氮（NO）,酶联免疫法测定内皮素1（ET-1）,酶联免疫吸附法检测脑钠尿肽（BNP）,微量法检测血清中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）。同一时间观察小型猪舌象并进行拍照,图像分析软件分析小型猪舌象色彩分级R、G、B值指标。1.4影像学评估心功能于术后30分钟及术后7天行心脏超声检查,术后7天行心脏核磁共振技术（MRI）观察小型猪心肌梗死情况。1.5心肌梗死面积计算及病理形态学观察术后7天处死所有动物并取其冠脉左前降支近端分布区域心肌;NB-T染色后用MPIAS-500型多媒体彩色病理图文分析系统软件测量心肌梗死面积。HE染色及Masson染色法观察心肌血管及心肌组织的病理变化。2.结果2.1舌象分析正常组小型猪舌质淡红,苔薄白;模型组小型猪舌质较正常组颜色偏暗,苔暗白,舌象R值降低,舌象G、B值均升高;SSNX组小型猪与模型组相比舌质暗红、苔暗白均有改善,舌象R值升高,舌象G、B值均显著降低。2.2各组小型猪生化指标比较模型组小型猪血清CK、CK-MB、LDH活性、cTnT含量较假手术组升高,SSNX组较模型组血清CK、CK-MB、LDH活性、cTnT含量降低。凝血功能相关指标显示,模型组较假手术组PT、APTT时间延长,FIB值减少;与模型组比较,SSNX各组PT、APTT时间缩短,FIB值升高。与假手术组比较,模型组SOD活力降低,MDA值升高;与模型组比较,各给药组SOD活力升高,MDA值降低。内皮功能指标显示,假手术组血清ET-1较模型组升高,NO值降低。各给药组与模型组比较,血清ET-1降低,NO值升高。模型组较假手术组BNP升高,SSNX各组较模型组BNP降低。2.3影像学评估心脏超声结果示,与正常组比较,模型组小型猪多项心脏功能指标发生变化,射血分数、短轴缩短分数降低,收缩末期内径、收缩末期体积、舒张末期内径、舒张末期体积升高;与模型组比较,双参宁心组小型猪射血分数EF、短轴缩短分数FS升高,舒张末期体积明显降低。MRI结果示,假手术组小型猪心脏结构完整,各瓣膜血流及开合无异常。模型组小型猪左心室及心内膜内侧出现大面积高密度影,甚有室间隔断裂现象,提示模型组小型猪心肌缺血程度严重,甚有心肌坏死出现,心肌损伤严重。SSNX给药组也可见部分高密度影,但高密度影面积较小,且心脏形态相对完整,损伤程度较模型组轻。2.4病理形态学观察HE及Masson染色示,正常组心肌纤维排列整齐,无变性坏死与肿胀断裂,无炎细胞浸润;模型组心肌纤维大片坏死、钙化,心肌纤维变性、断裂,纤维组织增生,炎细胞浸润,坏死区充血、出血;阳性药组肌纤维部分排列整齐,心肌细胞形态正常,心肌纤维中斑片状心肌纤维变性坏死及脂肪变性,伴部分组织增生、炎细胞浸润;SSNX各组心肌纤维大部排列整齐,心肌细胞核呈圆形,位于细胞中央,部分心肌纤维中斑片状心肌纤维变性坏死,伴少量增生、炎细胞浸润。2.5心梗面积比较与模型组比较,SSNX预防治疗组及SSNX治疗组心肌梗死面积与心肌总面积的比值明显降低,阳性药组心肌梗死面积与心肌总面积的比值较模型组亦降低。3.小结小型猪MIRI模型构建成功。SSNX可降低MIRI小型猪的血清心肌酶水平,改善血管内皮功能与凝血功能;还可通过升高SOD活性,降低MDA水平以抗氧化应激;可显著减少MIRI小型猪的心肌梗死面积。影像学与病理形态学表明,模型组心肌损伤最为严重,阳性药次之,SSNX治疗组随后,SSNX预防治疗组损伤最轻。上述研究结果证明,SSNX可改善MIRI小型猪的心功能,对MIRI所致的心肌损伤具有明确保护作用。第二部分双参宁心胶囊对小型猪MIRI线粒体自噬作用机制研究1.材料与方法1.1动物分组与给药方法与第一部分相同。1.2 ATP及Δψm检测评价能量代谢及线粒体功能取新鲜心肌组织通过磷钼酸比色法检测缺血心肌三磷酸腺苷（ATP）含量,荧光探针法检测心肌细胞中线粒体膜电位（Δψm）水平的变化。1.3心肌超微结构观察透射电镜下观察心肌细胞线粒体及线粒体自噬超微结构变化。1.4 qRT-PCR检测相关基因表达,Western Blot检测相关自噬蛋白表达水平实时荧光定量PCR法检测心肌组织中自噬相关基因的转录水平,Western Blot法测定心肌 LC3-B、cleaved caspase-3、PINK1、Parkin 蛋白表达情况。2.结果2.1各组小型猪能量代谢及线粒体功能比较与假手术组比较,模型组心肌ATP含量及线粒体膜电位显著降低;与模型组比较,SSNX各组心肌ATP含量及线粒体膜电位显著升高,阳性药组虽有升高趋势,但升高不如SSNX各组明显。2.2心肌超微结构透射电镜下可见假手术组小型猪心肌肌丝形态完整、排列紧密,线粒体膜结构和嵴结构基本正常,整体无明显肿胀,排列较好;模型组小型猪可见心肌肌丝明显断裂或疏松,线粒体肿胀变大或空泡化、内部结构疏松,心肌组织和线粒体内均有自噬体形成;SSNX治疗组,SSNX预防治疗组,阳性药组心肌肌丝虽有断裂或疏松,但较模型组程度显著减轻,线粒体肿胀变大但形态相对完好,嵴突疏松程度降低,整体无显著空泡化,心肌组织和线粒体内有少量自噬体结构。2.3相关蛋白基因表达水平比较qRT-PCR结果示,PINK1、Parkin、Cleaved caspase-3、LC3B的mRNA基因表达水平较模型组均显著升高;给药组各蛋白基因表达水平较模型组均呈显著下降趋势,且SSNX预防治疗组下降最明显,SSNX治疗组次之,其次是阳性药组。2.4相关自噬通路蛋白表达水平比较Western Blot结果示,模型组PINK1/Parkin通路、Cleaved caspase-3自噬凋亡通路、LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值表达水平较假手术组均呈升高趋势;给药组各蛋白表达水平较模型组均呈显著下降趋势,且SSNX预防治疗组下降值最明显,SSNX治疗组次之,阳性药组下降值相对较小,该结果与qRT-PCR趋势一致。3.小结小型猪MIRI心肌线粒体自噬增加,SSNX可减少线粒体膜电位及ATP含量,保护缺血再灌损伤后的心肌,其机制可能是通过抑制PINK1/Parkin自噬通路,抑制线粒体自噬的过度激活,减少心肌细胞凋亡和线粒体损伤而实现的。结论双参宁心胶囊对心肌缺血再灌注损伤小型猪心肌组织有保护作用,可减轻心肌组织结构损伤及维持线粒体功能相对完整,其机制可能是通过抑制PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬过度激活,从而保护心肌缺血再灌注损伤后小型猪心脏功能。