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目的和意义肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC),以下简称肝癌,是第三位导致癌症相关死亡的疾病。射频消融(Radiofrequency ablation,RFA)术是列入肝癌诊治指南的临床常用的根治性微创治疗技术。小肝癌RFA治疗的无瘤生存率较手术切除低,术后肿瘤易早期复发,复发的机制尚未完全阐明,但已明确与不充分的RFA(Insufficient or Incomplete RFA,IRFA)导致肝癌微观残留(微观残癌)有显著关系。目前认为微观残癌细胞的研究最终均需聚焦在细胞增殖或凋亡上,抑制残癌细胞增殖或促进残癌细胞凋亡是提高RFA疗效的关键,也是改善患者预后的关键。长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)在诸多肿瘤中异常表达,在肝癌发生发展过程中也发挥重要作用,参与细胞增殖的调控。综上,研究lncRNA在调控IRFA后残癌细胞增殖中的作用及分子机制有望为延缓肝癌复发提供治疗策略。因此,本研究以IRFA后微观残癌细胞为研究对象,建立50℃IRFA细胞和动物模型,采用基因芯片技术、RNA-蛋白互作等技术分析lncRNA在肝癌RFA术后残癌细胞增殖中的作用及机制。通过以上研究,将为促进残癌细胞凋亡,提高肝癌RFA疗效提供新思路、新方法。材料与方法50℃水浴热处理SMMC-7721肝癌细胞10分钟模拟IRFA后残癌细胞,恢复24h后提取细胞RNA,采用Agilent人lncRNA+mRNA芯片V4.0进行lncRNA+mRNA表达谱的检测。生物信息学方法分析差异表达的lncRNA和mRNA。然后筛选部分显著差异表达的lncRNA和mRNA进行qRT-PCR验证。确定要研究的靶lncRNA。lncRNA Pulldown实验检测与靶lncRNA结合的蛋白质。RACE实验测定lncRNA全长序列。双荧光素酶基因报告实验和ChIP实验检测与lncRNA基因结合的转录因子。Co-IP实验检测蛋白相互作用。FISH实验检测lncRNA的细胞定位以及与蛋白质的共定位。CCK-8法检测各组肝癌细胞增殖,慢病毒转染技术检测lncRNA的生物学功能。动物学实验在体验证lncRNA的生物学功能。qRT-PCR实验检测人体肝癌组织标本lncRNA表达情况。结果(1)获得50℃热处理10分钟组和正常培养组肝癌细胞的lncRNA和mRNA表达谱数据、差异表达的lncRNA和mRNA及其生物信息学分析数据(2)筛选23个差异表达的lncRNA和17个mRNA进行qRT-PCR验证,确定研究的靶lncRNA ENST00000570843.1,并命名为lncRNA SHILA(Sub-lethal Heat Inducing Long noncoding RNA)(3)lncRNA SHILA在50℃热处理10分钟的肝癌细胞中高表达且持续1周(4)转录因子IRF9促进lncRNA SHILA的表达(5)lncRNA SHILA定位于细胞质(6)lncRNA SHILA与ENO1蛋白和葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78kD,GRP78)蛋白结合,并下调ENO1表达水平(7)ENO1蛋白与HSC70(heat shock 70kDa protein 8)和HSP90(heat shock protein90)相互作用(8)50℃热处理10分钟的肝癌细胞增殖能力降低,ENO1表达降低(9)lncRNA SHILA抑制50℃热处理10分钟后的肝癌细胞增殖和裸鼠IRFA肝癌模型肝癌组织的生长(10)lncRNA SHILA在人肝癌组织中表达较癌旁组织降低结论(1)50℃热处理10分钟组与正常培养组肝癌细胞lncRNA和mRNA表达谱具有显著差异,生物信息学分析显示差异表达的mRNA主要与代谢信号通路相关(2)lncRNA+mRNA表达谱芯片检测结果与qRT-PCR验证结果具有一致性(3)50℃热处理上调肝癌细胞lncRNA SHILA表达,其中转录因子IRF9起促进作用(4)lncRNA SHILA负调控50℃热处理10分钟的肝癌细胞的ENO1蛋白表达水平(5)lncRNA SHILA抑制50℃热处理10分钟后的肝癌细胞的增殖