【摘 要】
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脂尾型绵羊是为适应极端环境气候变化从瘦尾型绵羊经过长期自然选择进化而来的。这类绵羊尾部脂肪沉积能力强,当处于寒冷、牧草营养失衡和枯草等环境时,仍可提供维持个体新陈代谢所必须的能量。脂肪沉积涉及脂肪细胞的连续分化和脂质累积。研究表明,HSD17B12和miR-136在动物脂质沉积中具有重要作用。然而,关于绵羊前体脂肪细胞中miR-136靶向HSD17B12的调控机制尚不清楚,有必要进行深入研究。本研
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（31972560）； 山西农业大学科技创新基金项目（2020YZ01）；
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脂尾型绵羊是为适应极端环境气候变化从瘦尾型绵羊经过长期自然选择进化而来的。这类绵羊尾部脂肪沉积能力强,当处于寒冷、牧草营养失衡和枯草等环境时,仍可提供维持个体新陈代谢所必须的能量。脂肪沉积涉及脂肪细胞的连续分化和脂质累积。研究表明,HSD17B12和miR-136在动物脂质沉积中具有重要作用。然而,关于绵羊前体脂肪细胞中miR-136靶向HSD17B12的调控机制尚不清楚,有必要进行深入研究。本研究以广灵大尾羊前体脂肪细胞为试验对象,通过转染miR-136 mimics和miR-136 inhibitors,实现miR-136过表达和抑制,利用q PCR、CCK-8、油红O染色、Western blotting等方法探究miR-136对绵羊前体脂肪细胞增殖和分化的影响;通过构建过表达miR-136脂肪细胞样本文库,进行二代转录组测序,筛选与脂肪相关的代谢通路;结合测序信息,采用生物信息学软件和双荧光素酶报告,预测并验证miR-136与HSD17B12的靶标关系;构建慢病毒介导的过表达和抑制HSD17B12载体,转染绵羊前体脂肪细胞,解析HSD17B12在绵羊前体脂肪细胞中的作用机制;过表达和抑制miR-136,在m RNA和蛋白水平检测HSD17B12的表达量,探讨miR-136对HSD17B12表达的影响。主要研究结果如下:1.在绵羊前体脂肪细胞中过表达miR-136,增殖标志基因m RNA表达量显著上调,细胞活力显著增强,成脂标志基因m RNA表达量显著下调,脂滴减少;抑制miR-136则结果相反。表明miR-136促进绵羊前体脂肪细胞增殖,抑制分化。2.过表达miR-136前体脂肪细胞的二代转录组测序结果表明,检测到45730046条clean reads;与参考基因组数据库比对,clean reads总比对率达到86.47%;与对照相比,发现1132个差异基因,其中579个下调,553个上调;112个差异基因功能富集于脂肪代谢相关通路,包括PPARα、PI3K-Akt、MAPK、ECM-受体相互作用、AMPK、Wnt和TGF-β信号通路等。3.生物信息学预测结果表明,miR-136与HSD17B12 3′-UTR存在结合位点。双荧光素酶报告表明,miR-136可以显著下调HSD17B12野生型双荧光载体的活性,空载组和突变型载体组都不受影响,验证二者存在靶标关系。4.绵羊HSD17B12 CDS全长939 bp,编码312个氨基酸,分子式为C1591H2532N402O443S12,蛋白分子量为34.76 KDa,理论等电点PI为9.49;主要定位于内质网,有3个跨膜结构域和33个磷酸化位点,二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成;绵羊HSD17B12与山羊相似性最高,与鸡的相似性最低。5.在绵羊前体脂肪细胞中,过表达HSD17B12后,HSD17B12 m RNA和蛋白表达量显著上调,增殖标志基因m RNA表达量下调,细胞活力显著减弱,成脂标志基因m RNA表达量显著上调,脂滴增多;抑制HSD17B12后,则结果相反。表明HSD17B12抑制绵羊前体脂肪细胞增殖,促进前体脂肪细胞分化。6.过表达miR-136后,HSD17B12 m RNA和蛋白表达量均显著下调。表明miR-136通过结合HSD17B12 3′-UTR抑制其表达。综上所述,miR-136靶向HSD17B12促进绵羊前体脂肪细胞增殖,抑制前体脂肪细胞分化和脂质沉积。研究结果为进一步阐明绵羊脂肪沉积的调控机制奠定理论基础。
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