多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一种单克隆浆细胞恶性增殖性疾病。近年MM的发病率有上升趋势，对人们的生命和生存质量已经构成越来越严重的威胁。虽然目前针对MM的治疗有多种治疗方案，但它仍然是不可治愈的疾病。如何治疗难治复发MM及提高它们的疗效是目前临床急需解决的问题。 c-Kit是一种Ⅲ型跨膜酪氨酸蛋白激酶受体。已有报道在MM中恶性浆细胞而非正常浆细胞c-Kit有一定比例的表达，可能可以作为难治复发性MM治疗的一个新靶点。Imatinib，是第一个特异性针对小分子酪氨酸激酶的抑制剂，最早用于治疗携带：Bcr/Abl融合基因的慢性粒细胞性白血病和Ph<+>的急性淋巴细胞白血病，通过作用于bcr/abl靶点，抑制bcr/abl阳性细胞的增殖，达到治疗目的。此外，它还可以抑制Arg、Kit和血小板衍化生长因子受体(PDGFR)的活性。其中最为成功的例子是用于治疗表达c-Kit(CD117)的胃肠基质细胞瘤(GISTS)，临床获得80﹪以上的缓解。 本课题的设想： Imatinib可以通过抑制c-Kit受体表达及相关信号传导通路的传递抑制肿瘤的发生，针对c-Kit在多发性骨髓瘤中有一定比例的表达，我们拟将格列卫用于干预c-Kit表达阳性的MM细胞株，了解Imatinib是否阿康玥抑制c-Kit阳性的MM细胞株，并进一步了解其抑制增殖和诱导凋亡的作用机制，为格列卫在MM中的临床应用奠定一定的理论基础。二、实验方法和结果1．Imatinib可以抑制c-Kit受体传导通路1.1 Imatinib可以抑制IL-6对c-Kit的促磷酸化作用首先了解MM的一个重要生长因子IL-6是否可以促进c-Kit受体的磷酸化水平。用IL-6刺激无血清培养后的KM3细胞，用WB法检测c-Kit的磷酸化水平，发现IL-6可以促进c-Kit的磷酸化。接着了解Imatinib是否可以抑制IL-6对c-Kit的促磷酸化作用，用不同浓度Imatinib处理KM3细胞4h后，加或不加IL-6，发现0.1μmol/L的Imatinib可以轻度促进c-Kit的磷酸化，10μmol/L的Imatinib可以明显阻断IL-6对c-Kit的促磷酸化作用。 1．2 Imatinib可以抑制c-Kit的表达不同浓度Imatinib作用KM3细胞24h后，用流式细胞仪技术和WB检测Imatinib对c-Kit受体表达的影响。结果发现经Imatinib处理后KM3细胞的c-Kit表达下调。 2．Imatinib对KM3细胞增殖和凋亡的影响2.1 Imatinib可以抑制KM3细胞的增殖采用XTT比色法检测。用不同浓度的Imatinib(0.01umol/L-50umol/L)处理KM3细胞48h后检测吸光度，发现浓度小于等于0.1μmol/L时，Imatinib可以促进KM3细胞增殖(P<0.05)；浓度增大0.25gmol/L或以上，则开始抑制细胞增殖，呈浓度依赖性。48h的IC 50为0.33μmol/L(P<0.01)。进一步研究发现，外源性IL-6不能阻断Imatinib的抑制增殖作用(P=0.2)。 2.2 Imatinib阻断KM3细胞在G0/G1期采用流式细胞技术检测不同浓度Imatinib处理后KM3细胞周期分布情况，发现经处理后KM3细胞G0/G1期细胞比例增加，S期比例减少，提示Imatinib通过阻滞细胞在GO/G1期抑制细胞增殖。 2.3 Imatinib可以促进KM3细胞的凋亡用Annexin V/PI FITC双标染色法检测细胞早期凋亡，发现与空白对照相比，用Imatinib处理后KM3细胞早期凋亡和晚期凋亡的细胞较对照组均明显增加，随着浓度的增大，早期凋亡细胞减少，晚期凋亡细胞增多，总凋亡率增加。用DNA凝胶电泳法检测细胞晚期凋亡，发现经处理后DNA凝胶电泳出现凋亡的特征性“梯状”条带。不同浓度Imatinib处理KM3细胞24h后，PRO-caspase-3表达逐渐下降，cleaved caspased-3表达增加，cleaved PAPP表达增加。 3．Imatinib对几条MAPK通路的影响3．1 Imatinib对ERK1/2通路的影响为了解ERK1/2通路对KM3细胞的影响，我们采用不同浓度MEK抑制剂PD98059单独处理或与Imatinib共同处理KM3细胞，用XTT法检测细胞增殖。结果PD98059浓度超过50μmol/L时，可以轻度抑制KM3细胞增殖(P<0.05)。PD98059与1μmol/L的Imatinib共同作用于KM3细胞有相加或协同作用。PD98059单独作用对KM3细胞凋亡没有明显影响，与Imatinib共同作用后凋亡率没有增加。 不同浓度Imatinib作用KM3细胞，加入或不加IL-6刺激KM3细胞。结果发现0.1μmol/L的Imatinib可以明显抑制MEK1/2和ERK1/2的磷酸化水平，减弱外源性IL-6对MEK1/2和ERK1/2的促磷酸化作用，10μmol/L的Imatinib几乎完全抑制MEK1/2的磷酸化水平，阻断外源性IL-6的促磷酸化作用。 3．2 Imatinib对p38 MAPK通路的影响0.1μmol/L的Imatinib可以促进p38 MAPK的磷酸化，浓度增加至10μmol/L时，则可以抑制p38 MAPK的磷酸化。p38 MAPK特异性抑制剂SB203580单独处理可以促进KM3细胞增殖，以5mol/L最明显；SB203580与Imatinib共同作用有明显拮抗作用，可以拮抗Imatinib的抑增殖和促凋亡作用。 3．3 Imatinib对ERK5通路的影响IL-6可以促进ERK5的磷酸化水平。0.1 μmol/L的Imatinib对ERK5的磷酸化水平没有明显影响，也没有减弱IL-6对KM3的促磷酸化作用；浓度增大至10μmol/L时，可以明显抑制ERK5的磷酸化水平，阻断IL-6对ERK5的促磷酸化作用。用不同浓度Imatinib作用KM3细胞24h后，ERK5的磷酸化水平和总蛋白表达均呈浓度依赖性下调。三、结论1．Imatinib可以抑制外源性IL-6激活的c-Kit信号传导通路。 2．Imatinib可以抑制KM3细胞增殖，促进细胞凋亡。 3．lmatinib可以通过激活caspase-3促进细胞凋亡。 4．Imatinib通过抑制ERK1/2抑制KM3细胞增殖。 5．Imatinib通过激活p38 MAPK通路抑制KM3细胞增殖，诱导细胞凋亡。 6．Imatinib可以抑制ERK5途径抑制KM3细胞增殖，诱导细胞凋亡。