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研究背景非酒精性脂肪肝病(NAFLD)作为一种常见的慢性肝病,不仅在成年人中发病率较高,而且逐渐成为儿童及青少年的常见慢性疾病。而NAFLD的发病机制目前尚不明确。早期认为NAFLD发病与“二次打击假说”和“多重打击模型”有关。而近几年随着对孕期营养的关注,揭示人类疾病胚胎起源假说与NAFLD的发生有关。人类疾病胚胎起源假说认为在孕期或哺乳期的营养与疾病会对子代的器官结构、生理功能以及成年后疾病发展都有着一定影响。若母鼠在怀孕和哺乳期肥胖或高脂饮食,则会增加子代NAFLD的发病,并引发多种代谢功能异常。肥胖和糖尿病孕产妇会增加其后代成年后代谢系统疾病的风险。因此母体肥胖与糖尿病是胎源性NAFLD的重要危险因素。甜菜碱,也称三甲基甘氨酸,作为一种植物性食物中的纯天然物质,是人体中重要的甲基供体。如果日常膳食中甜菜碱摄入不足可促使脂肪肝病的发生。本课题前期研究发现,NAFLD人群疾病程度随着甜菜碱含量降低而加重,而甜菜碱补充则可改善NAFLD小鼠的肝脏脂肪变性。而孕期甜菜碱干预是否能防治胎源性NAFLD尚未见报道。肝脏是脂代谢的中心器官,肝细胞中的甘油三酯(TG)水平主要取决于脂肪酸的合成、氧化分解和转运,且每条通路上的代谢酶都受到其基因的调控,而当编码这些酶的基因表达异常时必然会导致TG在肝脏的堆积。过氧化物酶增殖体激活受体γ辅激活物1α(PPARGC1A,PGC1a),是过氧化物酶体增殖物活化受体α(PPARa)的激活剂,是影响NAFLD过程中胰岛素抵抗、氧化磷酸化等的重要因素。PPARa可以激活相关酶的表达,使肝细胞内脂肪酸清除能力增强,进一步减少脂肪的蓄积。通过全基因组DNA甲基化芯片发现,与正常人群相比,NAFLD患者肝脏PGC1a呈现高甲基化,其基因表达降低。而胎源性NAFLD是否与脂代谢相关基因的甲基化异常有关尚未见报道。基于以上的背景,本研究通过动物实验来验证孕期甜菜碱摄入对胎源性NAFLD的改善效果,同时通过测定脂代谢基因的表达水平、甲基化水平和甲基供体代谢物来阐明甜菜碱改善胎源性NAFLD的甲基化机制。进而为孕产人群有针对性地进行膳食指导提供参考,从生命早期营养的角度防治NAFLD。实验对象和方法1.动物的造模与干预将80只4周龄无特定病原体(SPF)级C57BL/6J雌性小鼠按空腹体重用随机数字表分为4组:对照组、妊娠糖尿病(GDM)组、妊娠糖尿病+1%甜菜碱组和妊娠糖尿病+2%甜菜碱组。对照组正常饲料和饮水,其他三个组在4周内高脂饲料,常规饮水。喂养至8周龄,按照雌雄比2:1合笼,之后将受孕老鼠给予腹腔注射链脲佐菌素(STZ)来构建妊娠糖尿病模型,同时分别给予正常饲料、高脂饲料、高脂饲料+饮水中添加1%、2%甜菜碱(wt/vol)。实验一直喂养至仔鼠断乳时(仔鼠约3周龄),处死母鼠并取材。之后仔鼠正常饲料与饮水至8周龄处死,取出全血,以及心、肝、脾、肺等脏器。2.实验技术与检测方法(1)用全自动生化检测仪上对血生化指标进行检测;(2)依据组织甘油三酯酶法试剂盒说明书,取出50mg肝脏样品将其裂解,然后取出500μl裂解液用酶法测定肝脏TG含量;(3)对肝脏组织进行预处理后,用苏木素-伊红和油红O染色对其染色,观察结果并进行病理学评价;(4)用Trizol提取肝脏RNA,并用逆转录试盒剂将RNA逆转录成c DNA;再采用实时荧光定量PCR分别对肝脏FAS、ACC、PPARα、PGC1α、ACOX、MTTP、AGPAT2、Apo B48的mRNA表达量进行检测;(5)先用提取DNA试剂盒提取肝脏中的DNA,然后对DNA进行亚硫酸盐修饰,再采用PCR对产物进行扩增,最后用双脱氧脸终止法来测定ACC、PGC1α甲基化水平;(6)用Methyl Flash Methylated DNA Quantifications试剂盒测定肝脏DNA全基因组甲基化水平;(7)采用高效液相色谱测定血清甜菜碱、胆碱、肝脏同型半胱氨酸(Hcy)、S-腺苷蛋氨酸(SAM)和S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)的水平。实验结果1.甜菜碱对母鼠与仔鼠肝脏脂肪蓄积的影响在母鼠中,GDM组的体重、内脏脂肪、血清谷丙转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和葡萄糖(GLU)水平显著高于对照组(P<0.05),肝脏病理切片显示GDM组出现了脂肪变性,TG水平(0.025±0.004μmol/mg vs.0.017±0.003μmol/mg,P=0.05)显著升高,说明胎源性NAFLD建模成功。与GDM组母鼠相比,1%甜菜碱组和2%甜菜碱组都能够降低内脏脂肪重量(0.47±0.17g,0.47±0.13 g vs.0.65±0.17 g)、血清ALT(103.30±7.61 U/L,76.83±2.67U/L vs.116.13±1.1 U/L)、GLU(6.40±0.18 mmol/L,7.08±0.52 mmol/L vs.11.01±0.17 mmol/L)的水平。甜菜碱干预能明显降低肝脏脂肪变性程度,同时肝脏TG水平也明显降低(0.0180±0.002μmol/mg,0.019±0.002μmol/mg vs.0.025±0.004μmol/mg)。在仔鼠中,GDM组血清ALT比对照组要高(72.48±3.32 U/L vs.47.75±2.92 U/L,P<0.001),肝脏TG也明显升高(0.036±0.004μmol/mg vs.0.017±0.008μmol/mg,P=0.008)。与GDM组相比,1%和2%甜菜碱干预后的仔鼠血清ALT水平(51.71±2.36 U/L,55.35±1.60 U/L vs.72.48±3.32 U/L)和肝脏TG含量(0.018±0.002μmol/mg,0.020±0.003μmol/mg vs.0.036±0.004μmol/mg)显著降低。2.甜菜碱对胎源性NAFLD仔鼠肝脏脂肪代谢基因表达的影响子代肝脏中,与对照组相比,GDM组FAS(0.538±0.060 vs.1.097±0.164,P=0.003)与ACC(0.525±0.080 vs.1.031±0.086,P=0.011)表达下降,1%和2%甜菜碱干预后,FAS(0.627±0.083,0.923±0.099 vs.0.538±0.060)和ACC(0.593±0.098,1.001±0.138 vs.0.525±0.080)表达水平回升。GDM组与脂肪酸氧化相关的基因PGC1α(0.215±0.036 vs.1.107±0.170,P<0.001)、PPARα(0.286±0.063 vs.1.108±0.171,P=0.005)和ACOX(0.037±0.006 vs.0.963±0.335,P=1.25)表达低于对照组,1%和2%甜菜碱干预后对应的基因表达明显回升(0.326±0.052,0.558±0.090 vs.0.215±0.036;0.487±0.041,0.656±0.103 vs.0.286±0.063;0.066±0.007,1.539±0.276 vs.0.037±0.006)。与GDM组相比,转运脂肪相关基因MTTP的表达水平在1%和2%甜菜碱干预后有所下降(0.025±0.008,0.034±0.002 vs.0.682±0.073)。3.甜菜碱对胎源性NAFLD仔鼠肝脏PGC1α基因启动子甲基化水平影响与对照组相比,GDM仔鼠肝脏中PGC1α基因启动子区的-3685Cp G位点的甲基化程度显著升高(50.82±1.40%vs.42.65±2.36%,P=0.016),1%和2%甜菜碱干预后能降低PGC1α甲基化水平(45.56±1.74%,44.84±1.25%vs.50.82±1.40%)。PGC1α启动子甲基化水平与其对应的mRNA表达水平呈负相关(r=-0.500,P=0.021)。4.甜菜碱对胎源性NAFLD仔鼠肝脏甲基供体代谢产物影响肝脏全基因组DNA甲基化水平在各组之间没有统计学差异(P>0.05)。与GDM组相比,1%甜菜碱组的同型半胱氨酸水平(Hcy)显著降低(44.36±6.35ng/mg vs.76.10±6.84 ng/mg,P=0.004),1%和2%甜菜碱组的S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)水平显著下降(11.09±0.667 ng/mg,8.87±1.098 ng/mg vs.14.70±0.912 ng/mg)。研究结论1.妊娠糖尿病母鼠会引起胎源性非酒精性脂肪肝病,而孕期甜菜碱摄入能缓解母代和子代的肝脏脂肪变性和肝损伤。2.妊娠糖尿病组仔鼠FAS、ACC、PGC1α、PPARα和ACOX表达下降,而孕期甜菜碱摄入可以纠正这些脂代谢基因表达紊乱。3.孕期甜菜碱摄入降低肝脏同型半胱氨酸和S-腺苷同型半胱氨酸的水平,同时通过降低仔鼠肝脏PGC1α启动子的甲基化水平,来升高PGC1αmRNA表达。