【背景】汉滩病毒（Hantaan virus，HTNV）在我国主要引起肾综合征出血热（Hemorrhagicfever with renal syndrome，HFRS），该病危害极为严重，目前尚缺乏特效的治疗药物，主要使用疫苗进行预防。目前我国已成功研制HFRS灭活疫苗，其推广使用对预防HFRS的发生和流行起到了积极作用。但该类疫苗仍存在一些问题，主要是不能有效刺激细胞免疫应答，诱导机体产生中和抗体的能力也较弱，抗体滴度不高等，因而研发新型的HFRS疫苗成为当务之急。近年来，病毒样颗粒（Virus-like Particle，VLP）疫苗由于其安全性好和免疫原性强的优点使得其成为目前最有发展前景的新型基因工程候选疫苗之一。同时研究发现通过对VLP进行修饰，将细胞因子锚定到VLP表面使其成为嵌合VLP可以使其具有更好的免疫原性。本研究通过杆状病毒表达载体系统（Baculovirus expression vector system，BEVS）分别表达HTNV包膜糖蛋白（Glycoprotein，GP）和核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein，NP）来构建HTNV VLP，同时表达糖基磷脂酰肌醇（Glycosylphosphatidylinositol，GPI）锚定的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）或CD40配体（CD40Ligand，CD40L），使之修饰在VLP表面，获得了两种HTNV嵌合VLP（VLP-GM-CSF，VLP-CD40L），并对其生物学活性和免疫学特性进行了研究，以期为进一步研制HFRS新型基因工程疫苗奠定理论和实验基础。【方法】将HTNV76-118株编码GP的M基因和编码NP的S基因以及小鼠的GPI-GM-CSF（以下简称GM-CSF）、CD40L基因分别克隆入BEVS中的pFastBacTMDual转移载体中，构建各重组杆状病毒（recombinant Baculovirus，rBV）转移载体（pFastBacTMDual-M、pFastBacTMDual-S、pFastBacTMDual-GM-CSF、pFastBacTMDual-CD40L），酶切后琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，并进行序列测定。将构建好的各rBV转移载体分别转化大肠埃希菌（Escherichia coli，E.coli）DH10BacTM后提取各rBV杆粒，即Bacmid-M、Bacmid-S、Bacmid-GM-CSF、Bacmid-CD40L，并利用PCR进行鉴定。将构建好的各rBV杆粒转染sf9昆虫细胞后获得各rBV，分别命名为rBV-M、rBV-S、rBV-GM-CSF、rBV-CD40L。取各rBV感染sf9昆虫细胞，利用间接免疫荧光法（Indirect immunofluorescence assay，IFA）检测各目的蛋白的表达。将rBV-M、rBV-S以及rBV-GM-CSF或rBV-CD40L通过共感染sf9昆虫细胞的方式分别制备各组VLP（VLP、VLP-GM-CSF、VLP-CD40L），在电镜下观察sf9昆虫细胞内及培养上清中的各组VLP的组装情况。分别大量制备和收集各组VLP，通过蔗糖密度梯度离心法纯化各组VLP，并利用酶联免疫吸附试验（Enzyme-linkedimmunoadsordent assay，ELISA）、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳（Sodiumdodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、蛋白质印迹法（Westernblot，WB）、免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，Co-IP）等方法进行鉴定。在上述工作的基础上，研究分析了各组VLP的生物学活性及免疫学特性。通过流式细胞术（Flow cytometry，FCM）分别检测了各组VLP促小鼠骨髓细胞增殖能力、促小鼠骨髓细胞向树突状细胞（Dendritic cells，DC）分化能力以及促B淋巴细胞活化能力。将各组VLP通过皮下注射途径免疫C57BL/6小鼠，以添加外源重组细胞因子的VLP（VLP+GM-CSF、VLP+CD40L）、HFRS灭活疫苗以及PBS为对照。通过ELISA及微量细胞中和试验分别检测免疫后各组小鼠血清中抗HTNV GP及NP的特异性抗体及中和抗体的滴度，以反映各组小鼠的体液免疫应答的情况；通过酶联免疫斑点试验（Enzyme Linked Immunospot assay，ELISPOT）及细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T lymphocyte，CTL）杀伤试验分别检测免疫后各组小鼠脾细胞分泌细胞因子的水平以及其CTL杀伤活性，以反映各组小鼠的细胞免疫应答的情况；取HTNV76-118株通过肌肉注射途径接种各组免疫小鼠，通过ELISA及实时定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）分别检测接种后各组免疫小鼠脏器组织中HTNV抗原及核酸，通过苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin，HE）染色各组小鼠脏器组织并进行镜检，观察接种后各组免疫小鼠脏器组织的病理学变化，以评价各组VLP预防接种对HTNV感染的保护作用。【结果】将各目的片段克隆入BEVS转移载体后，酶切鉴定结果显示，各rBV转移载体均切出与相应目的基因大小相一致的核酸条带；测序结果显示，各目的基因序列正确，无突变产生，表明成功地构建了各rBV转移载体。对重组杆粒PCR鉴定结果显示，各rBV杆粒中均扩增出与预期大小相一致的核酸条带，证实各组rBV杆粒构建正确。将各重组杆粒转染昆虫细胞获得rBV，感染细胞后IFA检测结果显示，各组rBV均可表达相应的目的蛋白。将各rBV共感染昆虫细胞后，电镜观察结果显示，在昆虫细胞内及培养上清中均可清楚地观察到直径大小约为80~220nm的颗粒，初步判定为各组VLP。大量制备各组VLP，利用蔗糖密度梯度离心进行纯化，离心结束后能够清晰的观察到各组VLP的聚集带。SDS-PAGE及WB检测各组VLP，结果发现各组VLP中均含有与相应目的蛋白大小相一致的特异性蛋白条带。ELISA及Co-IP检测结果显示，在嵌合VLP中，GM-CSF或CD40L均成功地锚定在VLP上。对各VLP进行生物学活性检测的结果显示，各组VLP均可刺激小鼠骨髓细胞的增殖和向DC的分化，并有效地促进了小鼠B淋巴细胞的活化，且VLP-GM-CSF的刺激能力要强于VLP-CD40L和VLP（p<0.05）。对各VLP免疫小鼠进行免疫学活性检测的结果表明，各组VLP均可刺激C57BL/6小鼠产生针对HTNV GP、NP的特异性抗体以及中和抗体，且VLP-CD40L和VLP-GM-CSF组抗体滴度均高于VLP组、灭活疫苗组，以及相应的外源细胞因子添加组VLP+CD40L、VLP+GM-CSF，其中VLP-CD40L组抗体滴度最高（p<0.05）。在HTNV GP或NP刺激下，与PBS组相比，各组VLP均可增强小鼠脾细胞分泌IFN-γ和IL-2的水平，且VLP-CD40L、VLP-GM-CSF组小鼠脾细胞分泌IFN-γ和IL-2水平均高于VLP组、灭活疫苗组，以及相应的外源细胞因子添加组，其中VLP-CD40L组分泌水平最高（p<0.05），而各免疫组小鼠脾细胞分泌IL-4和IL-10的水平无明显差异（p>0.05）。在HTNV GP或NP刺激下，与PBS组相比，各组VLP均可增强小鼠脾细胞的杀伤活性，且随着效靶比（Effector cell/Target cell，E/T）的升高而增强。VLP-CD40L、VLP-GM-CSF组小鼠脾细胞杀伤活性在不同E/T时均高于VLP组、灭活疫苗组，以及相应的外源细胞因子添加组，其中VLP-CD40L组杀伤活性最高（p<0.05）。免疫小鼠保护实验的结果显示，PBS对照组小鼠的肝脏、脾脏和肾脏组织中的HTNV抗原检测均为阳性，而其他各实验组以及正常对照组小鼠的所有脏器组织均未检测到HTNV抗原。RT-PCR检测各组小鼠脏器中HTNV核酸的结果与病毒抗原结果结果相一致。HE染色镜检结果显示，PBS组小鼠的脾脏中出现了弥漫性出血，淋巴细胞弥漫性浸润以及白髓增多等病理学变化，而其他各实验组以及正常对照组小鼠的所有脏器组织均未观察到病理学变化。上述结果提示，HTNV能够感染未经免疫的C57BL/6小鼠，而经各VLP免疫后能够保护小鼠免受HTNV的攻击。【结论】本研究通过BEVS表达系统获得了嵌合有GM-CSF或CD40L的HTNV VLP，各嵌合VLP均具有有良好的生物学活性，同时嵌合在VLP表面的CD40L或GM-CSF有效地增强了其刺激机体产生特异性免疫应答的能力，且各项指标均优于HFRS灭活疫苗组。免疫小鼠保护实验结果证实嵌合VLP可以有效地保护C57BL/6小鼠免受HTNV的攻击。本研究为进一步研制HFRS新型基因工程疫苗奠定了良好的理论、实验和物质基础。